DIN EN ISO 18744:2016 Микробиология пищевой цепи. Обнаружение и подсчет Cryptosporidium и Giardia в свежих зеленых листовых овощах и ягодах (ISO 18744:2016); Немецкая версия EN ISO 18744:2016.

Стандартный №: DIN EN ISO 18744:2016
Дата публикации: 2016
Разместил: German Institute for Standardization
состояние: быть заменен
быть заменен: DIN EN ISO 18744:2016-12
Последняя версия: DIN EN ISO 18744/A1:2025-04
заменять: DIN EN ISO 18744:2014

сфера применения

Углубленный анализ ISO 18744:2016

ISO 18744:2016 — ключевой стандарт безопасности пищевых продуктов, выпущенный Международной организацией по стандартизации. Он специально посвящен методам обнаружения и подсчета двух важных пищевых паразитов — криптоспоридий и лямблий — в свежих листовых овощах и ягодах. Этот стандарт был совместно разработан ISO/TC 34 «Пищевые продукты» и CEN/TC 275 «Горизонтальные методы анализа пищевых продуктов» и официально выпущен и вступил в силу в октябре 2016 года.

Предыстория разработки стандартов и технологического развития

Криптоспоридии и лямблии — два важных кишечных паразита, которые могут передаваться через загрязненную воду и пищу, вызывая кишечные заболевания у людей. Оба паразита характеризуются наличием устойчивых трансмиссивных стадий – ооцист Cryptosporidium и цист Giardia lamblia, – которые могут длительное время сохранять жизнеспособность во влажной среде. Ооцисты Cryptosporidium особенно устойчивы к концентрациям хлора, используемым при очистке питьевой воды, а химическая дезинфекция листовых зелёных овощей и ягод в процессе обработки может быть неэффективной. Традиционные бактериологические индикаторы, такие как колиформные бактерии, ненадёжно указывают на присутствие этих паразитов, что требует применения специализированных методов обнаружения. Стандарт ISO 18744, основанный на опубликованных методах и валидированный многоцентровым кольцевым тестом, предоставляет унифицированный метод тестирования для пищевой промышленности. Принцип тестирования, используемый в настоящем стандарте, основан на элюировании (ЭО) цист из образца с последующим центрифугированием и концентрированием элюата с последующим разделением с помощью иммуномагнитной сепарации (ИМС). Детекция проводится микроскопически с использованием специфических моноклональных антител (мкАТ), конъюгированных с флуоресцентным красителем.

Этап обнаружения	Технические методы	Ключевые параметры	Требования к контролю качества
Предварительная обработка образца	Буферное элюирование	pH 5,5 (листовые овощи)/pH 3,5 (ягоды)	Внутренний контроль экстракции
Концентрирование и разделение	Центрифужное концентрирование	≤2500g, 10 минут	Проверка восстановления
Иммуномагнитное разделение	Технология IMS	Магнитные частицы, покрытые антителами	Положительный процесс контроль
Флуоресцентное окрашивание	FITC-mAbs/ DAPI	Специфическое мечение антител	Положительные и отрицательные контроли
Микроскопия	Флуоресцентный микроскоп	Увеличение 200-1000x	Регулярная калибровка

Ключевые технические требования и конфигурация оборудования

Необходимые реагенты и оборудование

Стандарт требует, чтобы лаборатория была оснащена полным набором оборудования для микробиологических испытаний, в том числе: колебательный гомогенизатор, центрифуга с охлаждением (совместимая с коническими центрифужными пробирками объемом 50 мл), иммуномагнитная сепарация система, флуоресцентный микроскоп (оснащенный наборами фильтров FITC и DAPI) и соответствующее оборудование для контроля температуры.

Ключевые реагенты включают: глициновый буфер (pH 5,5 для листовых овощей, pH 3,5 для ягод), метанол аналитической чистоты, специфические моноклональные антитела (против Cryptosporidium и/или Giardia), окрашивающий раствор DAPI и т. д.

Требования к обработке образцов

Минимальный размер образца для тестирования составляет 25 г, и рекомендуется однократная обработка не более 100 г. Для образцов листовых овощей целые чистые листья (исключая стебли) должны быть случайным образом выбраны из разных частей растения. Для образцов ягод образцы должны быть случайным образом отобраны из одной единицы.

Подробная процедура тестирования

Процедура обработки образцов листовых овощей

1. Поместите образец в фильтровальный пакет, чтобы избежать чрезмерной обработки.
2. Добавьте 200 мл глицинового буфера с pH 5,5.
3. Обработайте с помощью гомогенизатора с постукиванием при 200–300 об/мин в течение 30 секунд.
4. Соберите элюат в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
5. Центрифугируйте при скорости ≤2500 g в течение 10 минут, без торможения.
6. Осторожно удалите супернатант, чтобы не повредить осадок.
7. Ресуспендируйте и объедините осадок.
8. Оцените конечный объем осадка и ресуспендируйте.

Процедура обработки образца ягод

1. Поместите образец в контейнер объемом 500 мл с крышкой.
2. Добавьте 200 мл глицинового буфера с pH 3,5.
3. Осторожно перемешивайте в течение 1 минуты (вращая или медленно встряхивая).
4. Элюат фильтруется и собирается.
5. Этапы центрифугирования и концентрирования такие же, как для листовых овощей.

Технология иммуномагнитного разделения (ИМС)

Технология ИМС является основной технологией разделения этого стандарта. Она достигает максимального связывания путем смешивания концентрированного элюата образца с парамагнитными микросферами, покрытыми специфическими антителами в буферной среде. Затем магнит используется для отделения комплекса капсула (Оо)-микросфера от других компонентов образца. После разделения капсулы (Оо) диссоциируют от микросфер путем энергичного встряхивания в кислой среде.

Эта технология может эффективно улучшить специфичность обнаружения, снизить фоновые помехи и повысить чувствительность обнаружения. В настоящее время коммерческие тест-наборы, представленные на рынке, в основном предназначены для анализа концентратов образцов воды, но после соответствующей оптимизации их можно использовать и для анализа образцов пищевых продуктов.

Обнаружение и идентификация с помощью флуоресцентной микроскопии

Требования к конфигурации микроскопа

Стандарт требует использования эпифлуоресцентного микроскопа, предпочтительно оснащенного устройством дифференциально-интерференционного контраста (ДИК). Требуется как минимум два набора фильтров (три при использовании внутренних контролей экстракции): набор фильтров FITC (возбуждение 480 нм, испускание 520 нм), набор фильтров DAPI (возбуждение 375 нм, испускание 420 нм) и набор фильтров Texas Red (возбуждение 555 нм, испускание 630 нм).

Морфологические идентификационные характеристики

Характеристики	Ооцисты Cryptosporidium	Цисты Giardia lamblia
Характеристики флуоресценции	Яблочно-зелёная флуоресценция вокруг всей стенки ооцисты, часто с двойным краем	Яблочно-зелёная флуоресценция вокруг всей стенки цисты
Морфология	Сферическая или слегка овальная	Обычно овальная/овальная, может стать сферической при вертикальной сушке
Размер	4-6 мкм в диаметре	8-12 мкм × 7-10 мкм (при горизонтальной ориентации)
Окрашивание DAPI	Ядра спорозоитов выглядят как небольшие, четкие точки	Ядра трофозоитов выглядят как четкие точки, часто расположенные на одном полюсе цисты
Характеристики ДИК	Сферические или слегка овальные, гладкие, бесцветные с показателем преломления	Овальные, гладкие, с утолщенной стенкой цисты

Требования к контролю качества

Стандарт подчеркивает строгую систему контроля качества, включающую:

1. Внутренний контроль экстракции: используйте предварительно маркированную и подсчитанную суспензию (Oo) цист для проверки действительности процесса экстракции.
2. Положительный контроль процесса: Периодически (например, не реже одного раза из 20 образцов или не реже четырех раз в год) используйте образцы, в которые было добавлено около 100 (Оо) цист.
3. Отрицательный контроль: Используйте эквивалентный материал, предположительно не содержащий (Оо) цист, для проверки на перекрестное загрязнение.
4. Очистка оборудования: Очистите оборудование раствором гипохлорита, содержащим не менее 1000 мг/л свободного хлора.

Составление отчетов и интерпретация результатов

Результаты испытаний следует представлять в виде количества ооцист Cryptosporidium и/или цист Giardia, обнаруженных на единицу массы свежей продукции. При использовании внутреннего контроля экстракции процент извлечения следует рассчитывать для каждого образца; при использовании положительного контроля процесса процент извлечения следует рассчитывать. Отчет об испытаниях должен включать в себя следующую информацию: стандартную ссылку, полные данные об идентификации образца, дату отбора проб, качество образца, дату получения лаборатории, дату начала анализа, данные аналитического метода, количество обнаруженных образцов и соответствующие данные об идентификации. Данные об эффективности метода и валидации Данные о валидации, представленные в Приложении C стандарта, показывают, что извлечение этого метода различается для разных образцов: Извлечение ооцист Cryptosporidium: 25% для зеленого листового салата, 19% для салата Айсберг, 62% для смешанного салата и 64,7% для малины. Извлечение цист Giardia: 38% для зеленого листового салата, 16,7% для салата Айсберг и 53% для смешанного салата. Эти данные указывают на то, что производительность метода существенно зависит от матрицы образца, и лаборатории должны проводить соответствующую валидацию метода при применении этого метода. Рекомендации по внедрению и меры предосторожности Требования к компетентности лабораторий Внедрение настоящего стандарта требует, чтобы лаборатории обладали соответствующими техническими возможностями: умелыми навыками микроскопии, опытом проведения иммунологических исследований и хорошо налаженной системой управления качеством в лабораториях. В частности, микроскопическая идентификация требует значительного опыта и рекомендуется, чтобы ее выполнял специально обученный персонал.

Ограничения метода

Следует отметить, что этот стандартный метод не включает молекулярный анализ и, следовательно, не подходит для определения вида или генотипа/геногруппы ооцист Cryptosporidium и цист Giardia. Этот метод обнаруживает все виды и генотипы/геногруппы, известные как патогенные для человека, включая непатогенные виды. Для дальнейшей идентификации требуются тесты молекулярного типирования.

Кроме того, этот метод не может определить жизнеспособность или инфекционность любых ооцист Cryptosporidium и цист Giardia, которые могут присутствовать.

Направления будущего развития

С развитием технологии молекулярной биологии в будущем могут быть разработаны интегрированные методы, объединяющие традиционную микроскопию и молекулярную детекцию, для повышения специфичности и чувствительности обнаружения, одновременно достигая идентификации видов и оценки жизнеспособности.

Значение применения стандарта

Выпуск ISO 18744:2016 предоставляет унифицированный метод тестирования для мировой пищевой промышленности, который способствует:

1. Повысить точность и сопоставимость обнаружения паразитов в пищевых продуктах
2. Укрепить надзор за безопасностью пищевых продуктов и защитить здоровье потребителей
3. Содействовать международной торговле и снизить технические торговые барьеры
4. Обеспечить надежную поддержку данных для оценки риска

Этот стандарт применим не только к листовым овощам и ягодам, но также может быть применим к тестированию других свежих сельскохозяйственных продуктов после надлежащей валидации и имеет широкие перспективы применения.

DIN EN ISO 18744:2016 Ссылочный документ

DIN EN ISO 16140:2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов (ISO 16140:2003 + Поправка 1:2011); Немецкая версия EN ISO 16140:2003 + A1:2011.
DIN EN ISO 7218:2014 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и руководство по микробиологическим исследованиям (ISO 7218:2007 + Дополнения 1:2013); Немецкая версия EN ISO 7218:2007 + A1:2013.
ISO 16140:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов.
ISO 7218:2007 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям.

DIN EN ISO 18744:2016 История

2025 DIN EN ISO 18744/A1:2025-04 Микробиология пищевой цепочки - Обнаружение и количественное определение криптоспоридиумов и гiardii в свежих зеленых овощах и ягодных фруктах - Изменение 1 (ISO 18744:2016/DAM 1:2025); немецкая и английская версия EN ISO 18744:2016/prA1:2025
2016 DIN EN ISO 18744:2016-12 Микробиология пищевой цепи. Обнаружение и подсчет Cryptosporidium и Giardia в свежих зеленых листовых овощах и ягодах (ISO 18744:2016); Немецкая версия EN ISO 18744:2016.
2016 DIN EN ISO 18744:2016 Микробиология пищевой цепи. Обнаружение и подсчет Cryptosporidium и Giardia в свежих зеленых листовых овощах и ягодах (ISO 18744:2016); Немецкая версия EN ISO 18744:2016.
2014 DIN EN ISO 18744 E:2014-01 Микробиология пищевой цепи. Обнаружение и подсчет криптоспоридий и лямблий в свежих зеленых листовых овощах и ягодах (проект)

Микробиология пищевой цепи. Обнаружение и подсчет Cryptosporidium и Giardia в свежих зеленых листовых овощах и ягодах (ISO 18744:2016); Немецкая версия EN ISO 18744:2016.

DIN EN ISO 18744:2016Микробиология пищевой цепи. Обнаружение и подсчет Cryptosporidium и Giardia в свежих зеленых листовых овощах и ягодах (ISO 18744:2016); Немецкая версия EN ISO 18744:2016.