DIN EN ISO 18744:2016-12
Микробиология пищевой цепи. Обнаружение и подсчет Cryptosporidium и Giardia в свежих зеленых листовых овощах и ягодах (ISO 18744:2016); Немецкая версия EN ISO 18744:2016.

Стандартный №

DIN EN ISO 18744:2016-12

Дата публикации

2016

Разместил

German Institute for Standardization

состояние

быть заменен

быть заменен

DIN EN ISO 18744/A1:2025-04

Последняя версия

DIN EN ISO 18744/A1:2025-04

сфера применения

ISO 18744:2016 — ключевой стандарт микробиологических исследований безопасности пищевых продуктов. Он специально регламентирует выявление и подсчёт двух важных пищевых паразитов: криптоспоридий и лямблий в свежих листовых овощах и ягодах. Эти патогены передаются фекально-оральным путём и представляют серьёзную угрозу для здоровья населения, особенно ввиду высокой устойчивости их ооцист и цист к традиционным дезинфицирующим средствам.

---

Принцип и технический путь метода

Этап обработки	Листовые овощи (pH5,5)	Ягоды (pH3,5)	Основные технические параметры
Предварительная обработка образца	200 мл глицинового буфера, гомогенизация ткани в течение 30 секунд	200 мл глицинового буфера, осторожное перемешивание в течение 1 минуты	Избегайте механических повреждений образца и сохраняйте целостность ооцист
Центрифугирование при ≤2500g в течение 10 минут (без тормоз)	Центрифугирование при ≤2500g в течение 10 минут (без тормоза)	Для достижения эквивалентных показателей восстановления можно использовать центрифугирование при 1100g.
Иммуномагнитное разделение	Специфическое связывание магнитных частиц, покрытых антителами	Специфическое связывание магнитных частиц, покрытых антителами	Условия кислотной диссоциации: pH ≤ 3,0
Флуоресцентное окрашивание	ФИТЦ-конъюгированное моноклональное антитело + DAPI контрастное окрашивание	ФИТЦ-конъюгированное моноклональное антитело + DAPI Контрастное окрашивание	Высушите при 37-42 °C, инкубируйте в темноте.

---

Показатели эффективности теста и контроль качества

Стандарт требует от лабораторий создания комплексной системы контроля качества, включая внутренний контроль экстракции (IEC) и положительный контроль процесса (PPC). Внутренний контроль экстракции с использованием предварительно меченых флуоресцентных ооцист/цист, вносимых со скоростью 80-120 на образец, отслеживает валидность метода, начиная с этапа элюирования. Положительные контроли процесса рекомендуется проводить не реже одного раза на каждые 20 образцов, с минимальной частотой четыре раза в год. Типичные данные по извлечению показывают, что выделение Cryptosporidium составляет 10-62% для листовых овощей и 16,7-65% для Giardia. Коэффициенты выделения Cryptosporidium в ягодах могут достигать 64,7%. Это изменение в первую очередь обусловлено различиями в свойствах матрицы образца и методах работы.

---

Система микроскопических идентификационных признаков

Идентификационные признаки	Ооцисты криптоспоридий	Цисты лямблий	Метод подтверждения
Морфологические характеристики	Сферические/овальные, 4-6 мкм	Овальные, 8-12×7-10 мкм	ДИК-дифференциально-интерференционный контраст
Характеристики флуоресценции	Яблочно-зеленая кольцевая флуоресценция	Яблочно-зеленая кольцевая флуоресценция	Фильтр ФИТЦ (480/520 нм)
Окрашивание ядер	4 ядра спор отображаются как небесно-голубые точки	2-4 ядра сосредоточены в полярных областях	Фильтр DAPI (375/420 нм)
Специфические маркеры	Моноклональные антитела против Cryptosporidium	Моноклональные антитела против Giardia	Специфичность иммунофлуоресценции

---

Ограничения метода

Этот стандартный метод имеет следующие технические ограничения: во-первых, он не может различать патогенные и непатогенные виды; Все обнаруженные ооцисты/цисты требуют дальнейшей идентификации методом молекулярного типирования. Во-вторых, этот метод не позволяет определить жизнеспособность или инфекционность паразита. В-третьих, результаты молекулярного обнаружения могут быть искажены при использовании положительных контролей процесса. Наконец, этот метод требует высокого технического опыта оператора и навыков интерпретации микроскопических данных.

---

Рекомендации по применению и меры предосторожности

Обработка образцов: Для листовых овощей рекомендуется использовать целые листья (без стеблей); для ягод – оставлять плоды целыми. Вес образца должен составлять не менее 25 г, и за один раз можно обрабатывать не более 100 г. Образцы должны храниться в холодильнике при температуре 4-8 °C во время транспортировки, чтобы предотвратить порчу.

Предотвращение перекрестного загрязнения: Оборудование для обработки положительного контроля должно быть отделено от оборудования для обработки образцов, или должны использоваться эффективные меры дезактивации (обработка гипохлоритом натрия ≥1000 мг/л). Рекомендуется использовать одноразовые расходные материалы, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

Требования к обучению: Тестировщики должны пройти специализированное обучение по микроскопической идентификации, чтобы точно определять атипичные ооцисты/цисты и различать паразитоподобные мешающие вещества, такие как растительные остатки и дрожжи.

Требования к валидации метода: Когда лаборатория впервые внедряет этот метод, необходимо провести валидацию, включая тестирование на восстановление, тестирование специфичности и определение предела обнаружения, чтобы гарантировать пригодность метода в лабораторных условиях.

---

Предпосылки разработки стандарта и технологические инновации

Стандарт ISO 18744:2016 был разработан на основе результатов оценки воздействия на окружающую среду, полученных в нескольких лабораториях, и объединяет преимущества иммуномагнитной сепарации (ИМС) и иммунофлуоресцентной микроскопии (ИФА). По сравнению с традиционными методами, ключевые инновации этого метода включают: 1) оптимизированный pH элюирующего буфера для различных типов образцов (pH 5,5 для листовых овощей и pH 3,5 для ягод); 2) введение внутреннего контроля экстракции для обеспечения мониторинга процесса; и 3) установление многомерных критериев идентификации (морфология, флуоресценция и ядерное окрашивание).

Настоящий стандарт был разработан Техническим комитетом ISO/TC34/SC9 в сотрудничестве с Комитетом CEN/TC275 и был преобразован в национальные стандарты европейских стран до октября 2016 года. Он отражает растущее внимание к рискам, связанным с паразитами, при испытаниях безопасности пищевых продуктов и предоставляет унифицированные технические спецификации для оценки безопасности свежих сельскохозяйственных продуктов в международной торговле.

---

Перспективы применения и технологическое развитие

С ростом потребления свежих продуктов питания и расширением глобальных цепочек поставок прикладная ценность ISO 18744 становится все более заметной. Будущие технологические разработки могут быть сосредоточены на: 1) интеграции методов молекулярной диагностики для обеспечения возможности идентификации видов насекомых; 2) разработке автоматизированного испытательного оборудования для повышения эффективности испытаний; и 3) интеграции технологий испытаний на жизнеспособность для оценки фактических рисков. Будучи основополагающей технологией испытаний, текущий метод обеспечивает существенную техническую поддержку надзору за безопасностью пищевых продуктов.