DIN 10109:2016
Микробиологический анализ мяса и мясных продуктов. Определение аэробных молочнокислых бактерий. Метод шпателя.

Стандартный №

DIN 10109:2016

Дата публикации

2016

Разместил

German Institute for Standardization

состояние

быть заменен

быть заменен

DIN 10109:2016-05

Последняя версия

DIN 10109:2016-05

заменять

DIN 10109:1991 DIN 10109:2014

сфера применения

Обзор стандарта и развитие технологий

DIN 10109:2016, заменяющий DIN 10109:1991-09, имеет большое значение в области микробиологических исследований. Этот стандарт специально посвящен количественному выявлению аэробных молочнокислых бактерий в мясе и мясных продуктах с использованием метода шпателя для посева образцов. По сравнению с версией 1991 года, в данной редакции в первую очередь добавлен раздел с нормативными ссылками (глава 2) и требованиями к эксплуатационным испытаниям для обеспечения качества питательной среды (глава 5.4), а также внесены технические и редакционные изменения для соответствия текущим требованиям к дизайну.

---

Принцип испытания и характеристики метода

Настоящий стандарт основан на принципе селективных питательных сред и использует модифицированный агар MRS (pH 5,7) в качестве среды выделения. Молочнокислые бактерии образуют на этой среде характерные колонии, в то время как рост других загрязняющих веществ подавляется. Предел обнаружения данного метода составляет <10 КОЕ/мл для неразбавленных образцов и <100 КОЕ/г для разбавленных образцов. Условия культивирования: 25°C в аэробных условиях в течение 3 дней, что благоприятствует росту мезофильных молочнокислых бактерий и подавляет рост термофильных бактерий.

Технические параметры	DIN 10109:1991	DIN 10109:2016	Значимость улучшения
Нормативные ссылки	Не систематизировано	Новая глава 2	Улучшение координации стандартов
Контроль качества питательной среды	Нет конкретных требований	Новая глава 5.4 Тест производительности	Обеспечение точности обнаружения
Контроль pH	Общие требования	Точность до 5,8±0,1 (50 °C)	Повышенная воспроизводимость метода
Добавление сорбиновой кислоты	Описание селективности	Заданная концентрация 0,14%	Повышенное ингибирование дрожжей

---

Ключевые технологии приготовления питательной среды

Приготовление модифицированной питательной среды MRS является основной технологией настоящего стандарта. Формула содержит: 10,0 г триптатического пептона, 8,0 г мясного экстракта, 4,0 г порошка дрожжевого экстракта, 20,0 г глюкозы и 1,0 г Твин 80. Ключевое улучшение заключается в точном контроле pH: после охлаждения базальной среды до 50 °C отрегулируйте pH до 5,8 ± 0,1 с помощью 10% HCl. Конечное значение pH чашки Петри должно быть между 5,6 и 5,9 (при 25 °C). Добавление 10% раствора сорбиновой кислоты необязательно и в основном используется для подавления бактерий с высоким фоновым уровнем (в частности, дрожжей). Время важно: при приготовлении домашних питательных сред раствор сорбиновой кислоты следует добавлять до регулировки pH. Коммерческие сухие питательные среды обычно не содержат сорбиновой кислоты; требуется дополнительное добавление. Обработка образцов и процедуры инокуляции проводились в строгом соответствии с DIN EN ISO 6887-1 и 6887-2. Критическое время: время от приготовления первого разведения до инокуляции питательной среды не должно превышать 30 минут. Инокуляция проводилась с использованием дублирующего метода, с двумя чашками Петри для каждого разведения, каждая чашка инокулировалась 0,1 мл образца.

Для образцов с ожидаемо низким количеством бактерий можно использовать метод усиленной инокуляции: 1 мл неразбавленного образца следует равномерно распределить по 3-4 чашкам Петри. Важные меры предосторожности при инокуляции: начать с максимального разведения, предварительно трижды промыть пипетку и сразу же равномерно распределить шпателем после инокуляции.

---

Инкубация и интерпретация

Условия инкубации: аэробная инкубация при 25±1°C в течение 72±3 часов. Подсчитайте все хорошо выросшие белые или не совсем белые колонии, независимо от их плоского или приподнятого, гладкого или шероховатого внешнего вида. Допустимый диапазон подсчета: 1-150 колоний на чашку, который можно расширить до 300 колоний на чашку при хорошем разделении.

Метод расчета: Средневзвешенное значение: N = ΣC / (n1 + 0,1n2), где ΣC — общее количество колоний на всех допустимых чашках, n1 — количество чашек с минимальным разбавлением, а n2 — количество чашек с максимальным разбавлением. Окончательные результаты выражаются в КОЕ/г или КОЕ/мл и округляются до одной значащей цифры.

---

Обеспечение качества и проверка характеристик

Этот стандарт добавляет новые требования к испытаниям производительности питательной среды, включая проверку производительности и селективности. Производительность питательной среды проверяется с использованием референтных штаммов, таких как Lactobacillus sakei WDCM 00015 и Pediococcus pentosaceus WDCM 00158. Необходимо, чтобы степень извлечения составляла 70–130 %, с достаточным ингибированием контаминантов (таких как Escherichia coli и Staphylococcus aureus).

Проверка производительности также требуется для разведений, при этом отклонение количества колоний не должно превышать ±30 % от исходного значения. Внедрение этих мер контроля качества значительно повышает надежность результатов испытаний и межлабораторную сопоставимость.

---

Рекомендации по внедрению и меры предосторожности

Особое внимание следует уделять при внедрении настоящего стандарта: 1) Точный контроль pH питательной среды является ключом к успеху метода; 2) Добавление сорбиновой кислоты следует определять на основе фоновой флоры образца; 3) Температура культивирования должна строго контролироваться на уровне 25 °C, так как отклонение приведет к смещению результатов; 4) Интерпретация колоний требует опыта, и при необходимости следует проводить тест на каталазу или микроскопическое подтверждение.

Стандарт допускает использование автоматизированного оборудования, но требует проверки эквивалентности. Лаборатории должны разработать соответствующие стандартные операционные процедуры (СОП) и регулярно использовать референтные штаммы для проверки метода.

В стандарте особо отмечается, что могут возникнуть патентные проблемы, и пользователи должны иметь в виду, что при использовании эквивалентных продуктов они должны доказать, что могут получить те же результаты. Твин 80 упоминается как защищенный товарный знак, но использование эквивалентных продуктов разрешено.