SN/T 5364.2-2021
Метод выявления патогенных бактерий в пищевых продуктах на экспорт. Часть 2. Холерный вибрион методом капельной цифровой ПЦР. (Англоязычная версия)

Стандартный №

SN/T 5364.2-2021

язык

Китайский, Доступно на английском

Дата публикации

2021

Разместил

Professional Standard - Commodity Inspection

Последняя версия

SN/T 5364.2-2021

сфера применения

Техническое обоснование и эволюция стандарта

Являясь ключевым компонентом системы отраслевых стандартов контроля въезда-выезда и карантина, этот стандарт знаменует собой переход в технологии обнаружения пищевых патогенов в моей стране от традиционных методов культивирования к подходам молекулярной биологии. По сравнению с традиционным методом обнаружения, описанным в SN/T 1022, опубликованном в 2019 году, этот документ впервые использует инструмент для цифровой ПЦР-анализа капель для обнаружения холерного вибриона, что повышает чувствительность более чем в 10 раз.

---

Основной принцип обнаружения

Дизайн канала двойной флуоресценции:

Целевой ген	Функция	Флуоресцентное мечение	Значимость обнаружения
gbpA	Вид-специфический ген	FAM	Определение наличия Vibrio cholerae
tcpA	Ген вирулентности	VIC	Определение патогенных штаммов

Разделив реакционную систему на 10 000–20 000 капель, можно добиться абсолютной количественной оценки на уровне отдельных молекул, что позволяет отказаться от традиционной зависимости ПЦР от стандартных кривых.

---

Ключевые рабочие характеристики

Предварительная обработка образца

Необходимо строго соблюдать:

1. Первоначальное обогащение следует проводить в соответствии с SN/T1022 (инкубировать при 36℃±1℃ в течение 8–12 ч)
2. Перед выделением нуклеиновой кислоты ее необходимо обработать для удаления свободных нуклеаз (37℃ в течение 15–30 мин)
3. Для чистоты ДНК требуется соотношение A260/A280 1,8–2,0

Конфигурация реакционной системы

Ключевые параметры системы дуплексной ПЦР:

Компоненты	Конечный концентрация	Объем (система 20 мкл)

---

Важные моменты и предложения по реализации

Ключевые этапы контроля качества

• Необходимо настроить тройной контроль: положительный (ДНК Vibrio cholerae), отрицательный (ДНК Escherichia coli) и пустой (ультрачистая вода)
• Количество эффективных капель должно соответствовать требованиям прибора (обычно ≥10 000)
• Настройка порога должна обеспечивать полное разделение популяций отрицательных и положительных капель

Устранение неполадок

Проведите повторный тест при возникновении следующих ситуаций:

1. Сигнал амплификации появляется в отрицательном контроле
2. Отсутствие сигнала в положительный контроль
3. Не удалось сформировать капли (недостаточное количество эффективных капель)

Анализ технических преимуществ

Сравнение с традиционными методами:

Показатели	Метод цифровой ПЦР	Традиционный метод культивирования
Время обнаружения	4-6 часов	3-5 дней
Чувствительность	1-5КОЕ/25 г	10КОЕ/25 г
Обнаружение гена вирулентности	Завершено одновременно	Требуются дополнительные эксперименты
Способность противостоять интерференции	Устойчивость к ингибиторам ПЦР	Восприимчивость к комменсальным бактериям

SN/T 5364.2-2021 Ссылочный документ

• GB/T 27403-2008 Критерий контроля качества лабораторий. Молекулярно-биологическое тестирование пищевых продуктов.
• GB/T 6682  Вода для аналитических лабораторий. Спецификация и методы испытаний.
• SN/T 1022  Обнаружение холерного вибриона в пищевых продуктах при импорте и экспорте

SN/T 5364.2-2021 История

• 2021 SN/T 5364.2-2021 Метод выявления патогенных бактерий в пищевых продуктах на экспорт. Часть 2. Холерный вибрион методом капельной цифровой ПЦР.

Специальные темы по стандартам и нормам

стандарты и спецификации