SN/T 2563-2010
Обнаружение болезнетворных бактерий в мясе и мясных продуктах. MPCR-ДВЭЖХ (Англоязычная версия)
- Стандартный №
- SN/T 2563-2010
- язык
- Китайский, Доступно на английском
- Дата публикации
- 2010
- Разместил
- Professional Standard - Commodity Inspection
- Последняя версия
- SN/T 2563-2010
- сфера применения
-
Анализ технической базы SN/T 2563-2010
Этот стандарт, являющийся ключевой технической спецификацией для сферы контроля и карантина ввозимых и вывозимых товаров, впервые органично сочетает мультиплексную ПЦР с денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографией, создавая высокопроизводительную систему обнаружения шести распространённых патогенов в мясе и мясных продуктах. Этот стандарт был выпущен 27 мая 2010 года и официально вступил в силу 1 декабря того же года. Он был совместно разработан Бюро по инспекции въезда-выезда и карантину провинции Ляонин, Бюро по инспекции въезда-выезда и карантину провинции Хэйлунцзян и Beijing Yijiusi Technology Development Co., Ltd.
Углубленный анализ технического принципа
Основной механизм технологии MPCR
Технология мультиплексной ПЦР вводит несколько пар специфических праймеров в одну и ту же реакционную систему, что позволяет одновременно амплифицировать Salmonella (ген invA), Staphylococcus aureus (ген FemA), Listeria monocytogenes (ген prfA), Yersinia enterocolitica (ген ail), Campylobacter jejuni (ген cadF) и Streptococcus hemolyticus (ген ply). Эта конструкция с множественным параллельным обнаружением значительно повышает эффективность обнаружения, позволяя проводить первоначальный скрининг шести патогенов в одной реакции.
Принцип разделения DHPLC
Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография основана на принципе ион-парной обращенно-фазовой жидкостной хроматографии с использованием ацетата триэтиламмония (TEAA) в качестве ион-парного реагента. Отрицательно заряженные фосфатные группы во фрагментах ДНК электростатически притягивают положительно заряженные аминогруппы в TEAA, в то время как три этильные группы в TEAA образуют гидрофобные взаимодействия с C18 алкильными группами в неподвижной фазе. Точное разделение фрагментов ДНК различной длины в диапазоне от 63 до 338 п.н. может быть достигнуто с помощью градиентной элюции ацетонитрилом.
Сравнительный анализ стандартных методов
Параметры обнаружения Традиционный метод культивирования Обычный метод ПЦР Метод MPCR-DHPLC Цикл обнаружения 3-7 дней 1-2 дня Завершение в течение 1 дня Пропускная способность Обнаружение одного патогена Обнаружение одного патогена Одновременное обнаружение шести патогенов Чувствительность 10-100 КОЕ/г 10-100 КОЕ/г 10-100 КОЕ/г Уровень автоматизации В основном ручной Частично автоматизированный Высокоавтоматизированный Объективность результата Субъективная интерпретация Интерпретация электрофореза Объективная количественная оценка хроматографических пиков Стандартизированные рабочие процедуры
Характеристики предварительной обработки образцов
Этот стандарт строго определяет условия обогащения и культивирования для шести патогенов, все из которых относятся к соответствующим GB/T Стандарты серии 4789. Среда RV используется для Salmonella, 7,5% бульон с хлоридом натрия – для Staphylococcus aureus, а среда Фрейзера – для Listeria monocytogenes, что обеспечивает оптимальный рост каждого патогена. Контроль качества выделения ДНК: ДНК-матрица была подготовлена методом CTAB/хлорид натрия. Критические контрольные точки включают поддержание соотношения OD260/OD280 в пределах от 1,7 до 1,9, а точная концентрация ДНК определялась методом УФ-спектрофотометрии. Стандарт также допускает использование коммерческих наборов для выделения ДНК, что обеспечивает гибкость работы лабораторий. Оптимизация системы реакции mPCR: реакционная система объемом 50 мкл содержала 5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера, конечную концентрацию dNTP 0,3 ммоль/л и 1,5 ед. фермента Taq. Было разработано шесть пар праймеров с различными конечными концентрациями (соотношения 1:1,5:1,2:0,9:1:1,1), эффективно балансируя эффективность амплификации различных фрагментов гена. Условия реакции включали начальную денатурацию при 95 °C в течение 5 минут, затем 38 циклов: 95 °C в течение 10 секунд, 60 °C в течение 20 секунд и 72 °C в течение 60 секунд, затем финальную элонгацию при 72 °C в течение 7 минут.
Настройки параметров DHPLC
Хроматографический анализ проводили с использованием колонки PS-DVB & C18 DNASep (4,6 мм × 50 мм, 3 мкм) при температуре колонки 50 °C. Подвижная фаза использовала программу градиентной элюции: изначально 55% буфера A/45% буфера B, увеличивая до 50,2% A/49,8% B через 0,5 минуты и, наконец, до 42,6% A/57,4% B через 3,7 минуты. Скорость потока была установлена на 0,9 мл/мин, длина волны детектирования составляла 260 нм, а загрузка образца составляла 10 мкл.
Конструирование системы контроля качества
Требования к контролю
Стандарт предписывает включение положительных и отрицательных контролей для каждой партии тестирования. Положительный контроль должен демонстрировать типичный пик поглощения продукта ПЦР со значением пика более 3 мВ, в то время как отрицательный контроль не должен демонстрировать пика поглощения. Любые результаты, отклоняющиеся от этих стандартов контроля качества, будут считаться недействительными.
Критерии определения результата
Образец считается предположительно положительным на соответствующий патоген, если он демонстрирует типичный положительный пик поглощения продукта ПЦР, время пика соответствует положительному контролю, а пик поглощения превышает 3 мВ. Если пик меньше 3 мВ, стандарт требует повторного тестирования для обеспечения достоверности результатов.
Биологическая безопасность и предотвращение загрязнения
В главах 4 и 5 стандарта подробно описаны меры биологической безопасности и требования к утилизации отходов. Все культуры должны обрабатываться квалифицированным персоналом, а отходы должны быть автоклавированы при температуре 121 °C в течение 30 минут. Меры по предотвращению перекрестного загрязнения реализуются в соответствии с GB/T 27403 для обеспечения биологической безопасности лаборатории.
Технические преимущества и перспективы применения
Методические преимущества
Технология MPCR-DHPLC сочетает в себе высокопроизводительные возможности мультиплексной ПЦР с точными возможностями разделения DHPLC, преодолевая ограничения традиционных методов электрофореза, такие как низкое разрешение и плохая автоматизация. Этот метод позволяет одновременно различать фрагменты ДНК длиной от 63 до 338 пар оснований, обеспечивая техническую поддержку для быстрого скрининга пищевых патогенов.
Ценность применения в отрасли
Внедрение данного стандарта значительно повышает эффективность микробиологического тестирования импортируемых и экспортируемых мясных продуктов, сокращая время, требуемое традиционными методами, с нескольких дней до 24 часов. Он особенно подходит для быстрого скрининга больших партий образцов, предоставляя мощный технический инструмент для надзора за безопасностью пищевых продуктов.
Рекомендации по внедрению стандарта
Требования к строительству лаборатории
Внедрение этого стандарта требует использования основного оборудования, такого как ПЦР-инструмент, система DHPLC и высокоскоростная центрифуга. Разделение лаборатории должно соответствовать требованиям экспериментов по молекулярной биологии, чтобы избежать аэрозольного загрязнения. Операторы должны пройти профессиональную подготовку и иметь навыки в разработке праймеров MPCR и оптимизации параметров DHPLC.
Ключевые моменты валидации метода
Лаборатории должны проводить тщательную валидацию этого метода при его внедрении, включая такие показатели, как специфичность, чувствительность и воспроизводимость. Рекомендуется создать локальную базу данных с использованием стандартных штаммов для обеспечения точности и сопоставимости результатов испытаний.
Тенденции развития технологий
Благодаря развитию технологий молекулярной детекции в будущем станет возможным сочетание флуоресцентной ПЦР в реальном времени с технологией DHPLC для дальнейшего повышения чувствительности и количественной эффективности обнаружения. Кроме того, дизайн праймеров может быть расширен для большего числа пищевых патогенов, что позволит расширить спектр обнаружения.
SN/T 2563-2010 Ссылочный документ
- GB 19489 Лаборатории. Общие требования биобезопасности.
- GB/T 27403 Критерий контроля качества лабораторий. Молекулярно-биологическое тестирование пищевых продуктов.
- GB/T 4789.10 Микробиологическое исследование гигиены пищевых продуктов. Выявление золотистого стафилококка.
- GB/T 4789.11 Микробиологическое исследование гигиены пищевых продуктов Исследование на гемолитический стрептококк
- GB/T 4789.30 Микробиологическое исследование гигиены пищевых продуктов. Исследование Listeria monocytogenes.
- GB/T 4789.4 Микробиологическое исследование гигиены пищевых продуктов. Исследование на сальмонеллу
- GB/T 4789.8 Микробиологическое исследование гигиены пищевых продуктов. Исследование Yersinia enterocolitica.
- GB/T 4789.9 Микробиологическое исследование гигиены пищевых продуктов. Исследование Campylobacter jejuni.
- GB/T 6682 Вода для аналитических лабораторий. Спецификация и методы испытаний.
- SN/T 0184.1 Обнаружение Listeria monocytogenes в пищевых продуктах для импорта и экспорта
SN/T 2563-2010 История
- 2010 SN/T 2563-2010 Обнаружение болезнетворных бактерий в мясе и мясных продуктах. MPCR-ДВЭЖХ
