SN/T 2519-2010
Определение астровируса в моллюсках: обычный метод ОТ-ПЦР и метод ОТ-ПЦР в реальном времени. (Англоязычная версия)
- Стандартный №
- SN/T 2519-2010
- язык
- Китайский, Доступно на английском
- Дата публикации
- 2010
- Разместил
- Professional Standard - Commodity Inspection
- Последняя версия
- SN/T 2519-2010
- сфера применения
-
Обзор стандарта и техническая база
SN/T 2519-2010, «Обнаружение астровирусов в моллюсках: методы традиционной ПЦР и флуоресцентной ПЦР в реальном времени», — это отраслевой стандарт для контроля ввоза-вывоза и карантина, предложенный и координируемый Управлением по сертификации и аккредитации Китая (CNAS). Это первый отраслевой стандарт для контроля ввоза-вывоза и карантина, разработанный несколькими авторитетными организациями, включая Пекинское бюро контроля ввоза-вывоза и карантина Китайской Народной Республики и Научно-исследовательский институт технологий сертификации и аккредитации CNAS.
Астровирусы относятся к семейству Astroviridae, роду Astrovirus. Вирусные частицы имеют сферическую форму, без оболочки, диаметром 28–30 нм. Вирусный геном представляет собой одноцепочечную положительно-полярную РНК длиной 6,8 кб с полиА-хвостом на 3'-конце. Астровирусы являются значимым патогеном, вызывающим загрязнение моллюсков и представляющим серьезную угрозу безопасности пищевых продуктов.
Принципы методов обнаружения и технические пути
Настоящий стандарт предусматривает два основных метода выделения вирусной РНК: метод GPTT (метод глицин-ПЭГ-Тризол-олиго dT) и метод наномагнитных частиц. Оба метода основаны на одних и тех же технических принципах: гомогенизация для содействия высвобождению вирусных частиц, осаждение вируса с помощью ПЭГ8000, а затем выделение и очистка вирусной РНК с использованием различных методов.
Технические параметры Метод ГПТТ Метод наномагнитных частиц Объем обработки образца Общий супернатант (приблизительно 35 мл) 1 мл супернатанта Конечная концентрация ПЭГ 8% 2% Принцип извлечения РНК Лизис тризола + очистка олиго-dT магнитными частицами Прямое связывание с наномагнитными Бусины Процедура 7 основных этапов 6 основных этапов Сценарии применения Высокочувствительное обнаружение Быстрый скрининг Основные характеристики приготовления реагентов
В Приложении А к стандарту подробно описаны методы приготовления различных растворов для обеспечения экспериментальной точности и воспроизводимости.
Глициновый буфер (pH 9,5)
Содержит 0,1 моль/л глицина и 0,3 моль/л хлорида натрия. Используйте 7,50 г глицина высокой чистоты и 17,55 г хлорида натрия. Добавьте DEPC до конечной концентрации 0,05% и автоклавируйте при 121 °C в течение 15 минут. Этот буфер используется для гомогенизации образца для создания щелочной среды, способствующей высвобождению вируса.
Раствор ПЭГ8000
Содержит 16% (массовая концентрация) ПЭГ8000 и 0,525 моль/л хлорида натрия. Используйте 80 г высококачественного чистого ПЭГ8000 и 15,34 г хлорида натрия, также обработанного DEPC. ПЭГ используется для осаждения вирусов путем изменения осмотического давления раствора, что приводит к агрегации и осаждению вирусных частиц.
Подробная процедура испытания
Предварительная обработка образца
Добавьте 5 г ткани пищеварительной железы моллюска в 35 мл буфера для гомогенизации (pH 9,6) и тщательно гомогенизируйте в течение 2 минут. Поместите гомогенат в шейкер с воздушной баней при температуре 37 °C и скоростью вращения 200 об/мин на 30 минут для высвобождения вируса. Центрифугируйте при 10 000 g при 4 °C в течение 30 минут и удалите супернатант для последующего анализа.
Экстракция вирусной РНК
Метод GPTT: Перенесите весь супернатант в центрифужную пробирку объемом 50 мл, свободную от РНКазы, и добавьте равный объем 16% раствора ПЭГ8000. Инкубируйте на льду не менее 1 часа и центрифугируйте при 10 000 g в течение 10 минут при 4 °C. Растворите осадок в 5 мл реагента Trizol и экстрагируйте 1,2 мл хлороформа. Осаждайте РНК изопропанолом и, наконец, очищайте вирусную РНК с помощью Dynabeads Oligo(dT)25.
Метод наномагнитных частиц: возьмите 1 мл супернатанта и добавьте 0,14 мл 16% раствора ПЭГ8000. Инкубируйте на льду не менее 1 часа и центрифугируйте при 10 000 g в течение 10 минут при 4 °C. Ресуспендируйте осадок в связывающем буфере и добавьте наномагнитные частицы. Связывайте при комнатной температуре в течение 5–15 минут. После магнитного разделения проведите лизис нагреванием для высвобождения РНК.
Технические характеристики ПЦР-анализа
Реакция обратной транскрипции
Обратную транскрипцию проводили с использованием системы синтеза первой цепи Superscript III для набора ОТ-ПЦР. Реакционная система включала dNTP, нисходящие праймеры, матрицу РНК, буфер, MgCl2, DTT, RNaseOUT и фермент Superscript III в общем объеме 20 мкл. Условия реакции: инкубировать при 50 °C в течение 50 минут, затем нагревать при 85 °C в течение 5 минут для инактивации обратной транскриптазы.
Обычный анализ ОТ-ПЦР
Реакционная система включала буфер ПЦР, dNTP, восходящие и нисходящие праймеры, фермент Taq и матрицу кДНК в общем объеме 25 мкл. Для повышения чувствительности обнаружения использовали смесь из четырех пар восходящих праймеров (AstU1-4) и двух пар нисходящих праймеров (AstL1-2). Параметры реакции: 4 минуты начальной денатурации при 94 °C; 40 циклов по 30 секунд денатурации при 94 °C, 30 секунд отжига при 53 °C и 45 секунд элонгации при 72 °C; финальная элонгация при 72 °C в течение 5 минут. ПЦР-детекция в реальном времени: универсальная мастер-смесь для ПЦР (25 мкл), содержащая восходящие и нисходящие праймеры и зонд TaqMan. Параметры реакции: 2 минуты UNG при 50 °C; 10 минут горячего старта при 95 °C; 40 циклов по 15 секунд денатурации при 95 °C и 1 минуте отжига и элонгации при 60 °C. Зонд был помечен на 5'-конце FAM и гашен на 3'-конце TAMRA.
Метод обнаружения Чувствительность Специфичность Время обнаружения Сценарии применения Обычная ОТ-ПЦР Относительно высокая Требуется электрофорезная проверка 4-5 часов Традиционное обнаружение Флуоресцентная ПЦР в реальном времени Высокая Мониторинг в реальном времени 2-3 часа Экспресс-скрининг Критерии оценки результата
Результат обычной ПЦР оценка
Положительный контроль должен иметь амплифицированную полосу, тогда как отрицательный контроль и пустой контроль не должны иметь амплифицированной полосы. Если в исследуемом образце амплифицированные полосы не обнаружены, астровирус считается неопределяемым. Если амплифицированные полосы обнаружены, требуется проверка с помощью флуоресцентной ПЦР или анализа секвенирования.
Оценка результатов флуоресцентной ПЦР в реальном времени
Положительный контроль показывает амплификацию флуоресценции, тогда как отрицательный контроль и пустой контроль не показывают амплификацию флуоресценции. Образцы без амплификации флуоресценции считаются отрицательными; значение Ct ≤ 35 считается положительным; значение Ct между 35 и 40 требует повторного тестирования; Если повторно протестированное значение Ct остается в этом диапазоне, оно считается положительным.
Безопасность и контроль качества в лаборатории
Меры предосторожности в лаборатории применяются в соответствии с GB 19489. Диэтилпирокарбонат, используемый во время экспериментов, является канцерогенным, поэтому процедуры должны проводиться в вытяжном шкафу и в латексных или полиэтиленовых перчатках. Все использованные инструменты следует автоклавировать при температуре 121 °C в течение 30 минут перед очисткой.
Меры по предотвращению загрязнения применяются в соответствии с SN/T 1193, включая разделение лаборатории на зоны, контроль воздушного потока и средства защиты персонала. Набор следует хранить при температуре 4 °C, срок годности — 12 месяцев. Во время использования следует избегать загрязнения РНКазой.
Технические преимущества и инновации
Этот стандарт устанавливает первый стандартизированный метод обнаружения астровирусов в моллюсках, предлагая следующие технические преимущества:
Высокая чувствительность: конструкция с несколькими праймерами и два метода экстракции РНК обеспечивают чувствительность обнаружения; Высокая специфичность: конструкция и валидация последовательности обеспечивают специфичность обнаружения; Операционные характеристики: подробные рабочие процедуры и требования к контролю качества обеспечивают сопоставимость результатов; Передовая технология: она сочетает в себе традиционную обычную ПЦР с высокопроизводительной флуоресцентной ПЦР в реальном времени.
Рекомендации по внедрению и перспективы применения
Рекомендуется, чтобы следующие моменты были учтены при внедрении: создать строгую систему контроля качества и проводить регулярное обучение персонала и технические оценки; усилить управление биологической безопасностью в лаборатории, особенно использование опасных реагентов, таких как DEPC; установить стандартизированные процедуры сбора и хранения образцов; и проводить регулярные эксперименты по валидации методов и сравнительные эксперименты.
С развитием технологий молекулярной биологии этот стандарт обеспечивает важную техническую поддержку для импортно-экспортного контроля и карантина моллюсков и имеет большое значение для обеспечения безопасности пищевых продуктов и предотвращения распространения заболеваний пищевого происхождения. В будущем мультиплексные методы ПЦР-детекции и автоматизированные платформы детекции могут получить дальнейшее развитие для повышения эффективности и производительности обнаружения.
SN/T 2519-2010 Ссылочный документ
- GB 19489 Лаборатории. Общие требования биобезопасности.
- GB/T 6682 Вода для аналитических лабораторий. Спецификация и методы испытаний.
- SN/T 1193 Общие требования к лабораториям обнаружения и идентификации генов
SN/T 2519-2010 История
- 2010 SN/T 2519-2010 Определение астровируса в моллюсках: обычный метод ОТ-ПЦР и метод ОТ-ПЦР в реальном времени.
