ASTM E3011-22
Стандартная практика производства спор Clostridioides difficile in vitro
- Стандартный №
- ASTM E3011-22
- Дата публикации
- 2022
- Разместил
- American Society for Testing and Materials (ASTM)
- Последняя версия
- ASTM E3011-22
- сфера применения
-
Обзор стандарта и его техническая ценность
ASTM E3011-22 определяет технический процесс in vitro-подготовки спор Clostridioides difficile. Этот стандарт применяется к трём стандартным штаммам: ATCC 700792, ATCC 43598 и ATCC 43599. Суспензии спор, приготовленные по этому стандарту, могут использоваться в таких областях исследований, как тестирование эффективности противомикробных препаратов.
Сравнение основных технических требований
Технические показатели Версия E3011-15 Версия E3011-22 Требование к чистоте спор ≥90% ≥95% Время теста на устойчивость к кислоте Не указано 10 минут Выбор питательной среды Несколько вариантов Указанный печеночный бульон
Основные рабочие процедуры
1. Стадия культивирования спор
Используйте среду на основе печеночного бульона (HiMedia M928-500G) с соотношением инокулята 0,25–0,5 мл замороженной бактериальной суспензии на 1 л среды. Инкубируйте при температуре 36 ± 1°C в анаэробных условиях в течение 7–10 дней. Контролируйте споруляцию с помощью фазово-контрастного микроскопа (1000×).
2. Процедура очистки спор
- Профильтруйте питательную среду через двойной слой стерильной марли
- Центрифугируйте при 7500×g в течение 20 минут (20±2°C)
- Ресуспендируйте и промойте четыре раза холодной стерильной деионизированной водой
- Конечная концентрация спор должна достигать 8 log10 спор/мл
Стандарты контроля качества
Пример теста на устойчивость к кислоте: 10 мкл суспензии спор добавили к 990 мкл 2,5 М HCl. Через 10 минут смесь нейтрализовали фосфатным буфером с pH 11-12. Критерием приемлемости было снижение log10 на 0-2 по сравнению с контролем.
Формула расчёта:
% чистоты спор = (среднее количество спор/(среднее количество спор + среднее количество вегетативных клеток)) × 100
Рекомендации по применению и меры предосторожности
Требования биологической безопасности
Clostridium difficile — патоген 2-го уровня биологической безопасности (BSL-2). Операции должны проводиться в боксе биологической безопасности, а отходы должны стерилизоваться под высоким давлением при температуре 121 °C.
Решения распространенных проблем
- Недостаточная скорость образования спор: Увеличьте время инкубации до 14 дней или измените штамм
- Устойчивость к кислоте не соответствует стандарту: Проверьте количество промываний (не менее 4 раз) и температуру воды (5±3°C)
- Контроль загрязнения: Строго используйте предварительно восстановленную среду BHIY-HT
История развития стандарта
Основные изменения в издании 2022 года включают: повышение порога чистоты спор до 95%, уточнение параметров времени кислотного теста и стандартизацию источника питательной среды. Эти изменения обусловлены возросшими требованиями к воспроизводимости результатов испытаний на антимикробную активность и отражают углубленные исследования стабильности спор C. difficile, проведенные в последние годы.
ASTM E3011-22 Ссылочный документ
- ASTM E2756 Стандартная терминология, относящаяся к противомикробным и противовирусным препаратам*， 2024-05-15 Обновление
ASTM E3011-22 История
- 2022 ASTM E3011-22 Стандартная практика производства спор Clostridioides difficile in vitro
- 2015 ASTM E3011-15 Стандартный метод испытаний для производства спор Clostridium Difficile in vitro
