ASTM F2997-13 Стандартная практика количественного определения отложений кальция в остеогенной культуре клеток-предшественников с использованием анализа флуоресцентных изображений

Стандартный №: ASTM F2997-13
Дата публикации: 2013
Разместил: American Society for Testing and Materials (ASTM)
состояние: быть заменен
быть заменен: ASTM F2997-21
Последняя версия: ASTM F2997-21

сфера применения: 5.1. Анализы дифференцировки остеобластов in vitro являются одним из подходов к скринингу стволовых клеток-предшественников на предмет их способности превращаться в остеобласты. Степень кальцинированных отложений или минерализованного матрикса, образующихся in vitro, может быть индикатором дифференцировки в функциональные остеобласты; однако экспрессия остеогенных генов или белков является еще одним важным показателем, который следует использовать в сочетании с этим анализом для определения присутствия остеобластов. 5.2 Этот метод испытаний обеспечивает технику окрашивания, визуализации и количественной оценки интенсивности и площади флуоресценции, связанной с минерализацией, в культурах живых клеток с использованием нетоксичного кальций-хелатного красителя ксиленолового оранжевого. Положительно окрашенная площадь минерализованных отложений в клеточных культурах является косвенным показателем содержания кальция. Важно измерить интенсивность, чтобы убедиться, что изображения не были недоэкспонированы или переэкспонированы. Интенсивность не коррелирует напрямую с содержанием кальция, а также с площадью. 5.3 Ксиленоловый оранжевый позволяет многократно контролировать кальцинированные отложения на протяжении всей жизни культуры без ущерба для культуры. Последующие измерения площади минерализации не оказывают помех из-за накопления красителя в результате повторного нанесения (1).3 Кальцифицированные отложения, которые были окрашены ранее, могут выглядеть ярче, но это не влияет на измерение площади. Для этой цели также можно использовать красители кальцеин (1), но они требуют другой процедуры анализа, чем ксиленоловый оранжевый (т.е. концентрации и наборы фильтров), и поэтому сюда не включены. Ализарин Ред и фон Косса не подходят для этой процедуры на живых культурах, поскольку нет документации, подтверждающей их повторное использование в живых культурах без вредных последствий. 5.4. Этот метод испытаний можно применять к культурам любых клеток, способных образовывать кальцинированные отложения. Его также можно использовать для документирования отсутствия минералов в культурах, где цель состоит в том, чтобы избежать минерализации. 5.5. Во время анализов дифференцировки остеобластов используются остеогенные добавки, чтобы индуцировать или способствовать процессу дифференцировки. Если остеогенные добавки используются в избытке, в культурах клеток может возникнуть кальцинированный отложения, которые не опосредованы остеобластами и поэтому называются дистрофическими, патологическими или артефактными (2). Например, когда в среде используются более высокие концентрации бета-глицерофосфата, который действует в качестве субстрата для фермента щелочной фосфатазы, секретируемого клетками, наблюдается заметное увеличение свободного фосфата, который затем осаждается ионами Са++ в среде с образованием кристаллы фосфата кальция независимо от статуса дифференцировки клетки-предшественника. Продукция щелочной фосфатазы связана с дифференцировкой клеток-предшественников и часто стимулируется добавлением в среду дексаметазона, который усиливает образование кальцинированных отложений. Таким образом, эти виды кальцинированных/минеральных отложений считаются дистрофическими, патологическими или артефактными, поскольку они не были инициированы зрелым остеобластом. Таким образом, измерения, полученные с помощью этой практики, могут привести к потенциально ложной интерпретации статуса дифференцировки остеопрогениторных клеток, если они используются изолированно без данных об экспрессии генов или белков (3,4). 5.6x00а............

ASTM F2997-13 Ссылочный документ

ASTM F2312 Стандартная терминология, относящаяся к медицинским продуктам тканевой инженерии
ASTM F2603 Стандартное руководство по интерпретации изображений полимерных тканевых каркасов
ASTM F2739 Стандартное руководство по количественной оценке жизнеспособности клеток и связанных с ней атрибутов в каркасах биоматериалов

ASTM F2997-13 История

2021 ASTM F2997-21 Стандартная практика количественного определения отложений кальция в остеогенной культуре клеток-предшественников с использованием анализа флуоресцентных изображений
2013 ASTM F2997-13 Стандартная практика количественного определения отложений кальция в остеогенной культуре клеток-предшественников с использованием анализа флуоресцентных изображений