ISO/TS 29843-1:2010
Качество почвы. Определение микробного разнообразия почвы. Часть 1. Метод анализа жирных кислот фосфолипидов (PLFA) и анализа липидов эфиров фосфолипидов (PLEL).

Стандартный №

ISO/TS 29843-1:2010

Дата публикации

2010

Разместил

International Organization for Standardization (ISO)

Последняя версия

ISO/TS 29843-1:2010

сфера применения

Обзор стандарта и техническая база

ISO/TS 29843-1:2010 — это техническая спецификация качества почвы, опубликованная Международной организацией по стандартизации, в которой конкретно рассматриваются методы измерения микробного разнообразия почвы. В этом стандарте используются методы анализа жирных кислот фосфолипидов (PLFA) и анализа липидов эфиров фосфолипидов (PLEL), предоставляющие важные инструменты фенотипического анализа для оценки экосистемы почвы. Дополняя молекулярно-генетические методы, эти методы могут точно отражать активную биомассу трех основных доменов бактерий, грибов и архей в почве.

Принцип метода и техническая структура

Этот стандарт количественно характеризует структуру микробного сообщества посредством химического анализа, основанного на характеристиках стабильности фосфолипидных компонентов мембран микробных клеток. Фосфолипиды являются важнейшими компонентами всех живых клеточных мембран. Их боковые цепи жирных кислот (PLFA) или эфирно-связанные изопреноидные боковые цепи (PLEL) видоспецифичны и могут отражать таксономические различия в сложных микробных сообществах.

Тип анализа	Целевые микроорганизмы	Технические характеристики	Преимущества применения
Анализ PLFA	Бактерии и грибы	Гидролиз эфирных связей + метилирование	Отражение изменений в физиологическом состоянии
Анализ PLEL	Архей	Расщепление эфирных связей + восстановительное дегалогенирование	Специфическое обнаружение сообществ архей
Расширенный Методы	Целые микробные сообщества	Технология комплексного разделения	Комплексная оценка биоразнообразия

---

Подробное описание основной операционной процедуры

Этап экстракции липидов

Общие липиды экстрагировали из образцов почвы массой 10–25 г классическим методом экстракции Блай-Дайера с использованием буферной системы метанол-хлороформ-фосфат (2:1:0,8) при определенных значениях pH. Процесс экстракции требовал строгих временных параметров: 2 часа встряхивания, а затем 24 часа отдыха для полного растворения липидов.

Методика хроматографического разделения

Фракционирование липидов проводили на колонке с силикагелем (sI-колонка), последовательно элюируя нейтральные липиды, гликолипиды и фосфолипиды хлороформом, ацетоном и метанолом. Фракцию фосфолипидов дополнительно очищали на колонке с аминогруппами (NH2-колонка) и на колонке с сильным катионообменником (SCX-колонка).

Этапы разделения	Тип колонки	Цель разделения	Элюирующий растворитель
Первичное разделение	Колонка с силикагелем	Фосфолипидный компонент	Метанол (4V)
Разделение PLFA	Аминоколонка	МЭЖК/ПЛОН	Градиентное элюирование
Тонкое разделение	Колонка SCX	НАСЫЩЕННЫЕ ЖЕЛЕЗО/МНЖК/ПНЖК	Ионы серебра хроматография

Дериватизация

Для различных типов жирных кислот была проведена специфическая дериватизация: гидроксизамещенные жирные кислоты (PLOH) были дериватизированы с помощью TMSI, а мононенасыщенные жирные кислоты (MUFA) были дериватизированы с помощью DMDS для обеспечения точности и чувствительности обнаружения ГХ/МС.

---

Инструментальный анализ и количественный расчет

Условия обнаружения ГХ/МС

Анализ был проведен с использованием газовой хроматографии-масс-спектрометрии, оснащенной капиллярной колонкой (50 м × 0,2 мм, толщина пленки 0,3 мкм). Анализ PLFA использовал температурную программу: 70 °C (2 мин) → 160 °C (40 °C/мин) → 280 °C (3 °C/мин, выдержка 10 мин); анализ PLEL использовал следующие условия: 70 °C (2 мин) → 130 °C (30 °C/мин) → 320 °C (4 °C/мин, выдержка 30 мин).

Метод количественного расчета

Количественное определение проводили методом внутреннего стандарта, используя метиловый эфир нонадекановой кислоты (C19:0 FAME) в качестве внутреннего стандарта. Формула расчета: c = (Rf × k × m × 1000) / (Ri × V × M), где c — концентрация целевого соединения в почве (нмоль/г), а Rf и Ri — отклики целевого соединения и внутреннего стандарта соответственно.

---

Технические преимущества и прикладная ценность

Методические преимущества

По сравнению с простым методом экстракции PLFA в ISO/TS 29843-2 этот расширенный метод предлагает более комплексные аналитические возможности: он может одновременно обнаруживать гидроксилзамещенные жирные кислоты (PLOH), неэстерифицированные жирные кислоты (NEL-PLFA) и фосфолипидные эфиры липидов (PLEL), предоставляя более полную информацию о микробном сообществе.

Экологическое применение

Этот метод используется не только для оценки микробной биомассы, но и отражает изменения в Физиологический статус микроорганизмов. Например, грамотрицательные бактерии преобразуют моноеновые кислоты PLFA 16:1ω7c и 18:1ω7c в циклопропиловые жирные кислоты cy17:0 и cy19:0 под воздействием окружающей среды, и эта особенность может служить биомаркером экологического стресса.

Области применения	Аналитические показатели	Экологическая значимость	Интерпретация данных
Оценка здоровья почвы	Общее содержание PLFA	Активная микробная биомасса	Молярный процент
Экология загрязнения	Специфические маркеры PLFA	Изменения структуры сообщества	Анализ главных компонентов
Управление сельским хозяйством	Соотношение грибов и бактерий	Функциональное состояние почвы	Соотношение биомаркеров

---

Рекомендации по внедрению стандарта

Ключевые моменты предварительной обработки образцов

Образцы почвы следует собирать и обрабатывать в строгом соответствии с ISO 10381-6. Свежепросеянные образцы, которые невозможно проанализировать немедленно, следует хранить при температуре -20°C или в хлороформе после экстракции липидов, чтобы предотвратить изменения в структуре микробного сообщества.

Меры контроля качества

На протяжении всего эксперимента необходимо использовать одобренные аналитические реагенты, а все реакции дериватизации следует проводить при строго контролируемых температурных и временных условиях. Рекомендуется проводить холостые контроли и эксперименты по извлечению добавок для каждой партии образцов, чтобы гарантировать точность и сопоставимость аналитических результатов.

Руководство по интерпретации данных

В дополнение к абсолютным концентрациям отдельных МЭЖК рекомендуется нормализация данных с использованием молярных процентов для облегчения сравнения между различными образцами. Для анализа различий между обработками рекомендуются многомерные статистические методы, такие как анализ главных компонентов (PCA), для интерпретации изменений в микробном сообществе с точки зрения общей закономерности.

Технологическая эволюция и перспективы

С тех пор, как Уайт и соавторы впервые предложили липидно-фосфатный метод для измерения микробной биомассы осадка в 1979 году, технология PLFA претерпела значительную технологическую эволюцию. Этот стандарт представляет собой наиболее зрелый метод фенотипирования, который в настоящее время используется в исследованиях микробной экологии почвы, эффективно дополняя методы молекулярной биологии. Будущие направления развития включают интегрированные приложения с технологией метагеномики и расширенные приложения для оценки изменения климата и управления земельными ресурсами.