SN/T 2022-2007
Протокол полимеразной цепной реакции (ПЦР) на Eperythrozoon wenyoni (Англоязычная версия)
- Стандартный №
- SN/T 2022-2007
- язык
- Китайский, Доступно на английском
- Дата публикации
- 2007
- Разместил
- Professional Standard - Commodity Inspection
- Последняя версия
- SN/T 2022-2007
- сфера применения
-
Обзор стандарта и техническая база
SN/T 2022-2007, «Процедура полимеразной цепной реакции для выявления Eperythrozoon wensoni у крупного рогатого скота», — первый стандартизированный метод выявления Eperythrozoon wensoni у крупного рогатого скота в сфере инспекции и карантина въезда-выезда в моей стране. Этот стандарт был выпущен 24 декабря 2007 года и официально вступил в силу 1 июля 2008 года. Он был совместно разработан Шанхайским бюро инспекции и карантина въезда-выезда и Хуачжунским сельскохозяйственным университетом. Eperythrozoon wensoni — это риккетсиоз рода Eperythrozoon, паразитирующий преимущественно на поверхности эритроцитов крупного рогатого скота или существующий в свободном виде в плазме. Патоген может передаваться различными путями, включая кровососущих насекомых, клещей, материнскую плаценту и кровь. Хотя первоначальное заражение обычно не вызывает очевидных клинических симптомов, тяжелая инфекция может привести к типичным симптомам, таким как лихорадка, потеря веса и желтуха, что представляет потенциальную угрозу для животноводческой отрасли.
Технические принципы и инновации
Этот стандарт основан на консервативной последовательности гена 16S рРНК Eperythrozoon wenseri, и разработана пара специфических праймеров mwF/mwR3. Благодаря оптимизации условий реакции ПЦР фрагмент ДНК длиной 738 п.н. может быть специфически амплифицирован для достижения точной идентификации патогена.
Суть технологической инновации заключается в специфичности дизайна праймера. Прямой праймер mwF расположен на участках 106–132 гена 16S рРНК, а обратный праймер mwR3 — на участках 826–843. Такая конструкция обеспечивает высокую специфичность теста и позволяет избежать перекрестных реакций с другими патогенами.
Технические параметры Традиционный метод Этот стандартный метод ПЦР Технические преимущества Чувствительность обнаружения 10^4-10^5 бактерий/мл 10-100 бактерий/мл Чувствительность увеличена в 1000 раз Время обнаружения 3-7 дней 4-6 часов Значительно улучшенная своевременность Специфичность Склонен к перекрестные реакции Высокая специфичность Точность более 98% Операционная сложность Требуются профессиональные навыки в области микробиологии Стандартизированные рабочие процедуры Простота продвижения и внедрения Требования к экспериментальному оборудованию и материалам
Конфигурация прибора
Стандарт требует, чтобы лаборатории были оснащены полной системой молекулярно-биологического испытательного оборудования, включая основное оборудование, такое как ПЦР-амплификатор, аппарат для электрофореза и система визуализации геля. ПЦР-амплификатор должен иметь точный контроль температуры для обеспечения стабильных условий реакции.
Характеристики реагентов и расходных материалов
Конфигурация реагентов строго соответствует нормативным требованиям, изложенным в Приложении А. Ключевые реагенты включают в себя: Taq-фермент, dNTPs, праймеры, агарозу и т. д. Все химические реагенты должны быть аналитической степени чистоты для обеспечения надежности экспериментальных результатов.
Подробная операционная процедура
Сбор и обработка образцов
Образцы собираются с использованием стерильных методов забора крови с использованием 3,8% цитрата натрия в качестве антикоагулянта. Обработка образцов включает несколько ключевых этапов, включая переваривание лизоцимом, лизис SDS, обработку CTAB и экстракцию фенолом-хлороформом. Каждый этап имеет строгие временные и контрольные параметры.
Оптимизация системы ПЦР-реакции
Общий объём реакционной смеси составил 30 мкл, включая 3 мкл 10-кратного буфера для ПЦР-реакции, 3 мкл MgCl₂, 3 мкл dNTP и 1 мкл каждого праймера. Условия реакции: начальная денатурация при 94 °C в течение 3 минут, затем 35 циклов: 94 °C в течение 30 секунд, 50 °C в течение 30 секунд и 72 °C в течение 1 минуты, затем финальная элонгация при 72 °C в течение 3 минут.
Компоненты реакции Объем (мкл) Конечная концентрация Функция 10×ПЦР-буфер 3 1× Обеспечение реакционной среды MgCl₂ 3 1,5 ммоль/л Необходимый фактор для активности фермента dNTPs 3 0,2 ммоль/л Синтетическое сырье Праймер mwF/mwR3 1 каждый 0,2 мкмоль/л Специфическое связывание Фермент Taq 0,2 1 U Катализируемый синтез Критерии оценки результатов
Требования к контролю
Стандарт чётко требует создания положительного, отрицательного и холостого контролей. Положительный контроль использует рекомбинантную плазмиду, сконструированную в T-векторе, отрицательный контроль — заведомо отрицательный образец, а холостой контроль — стерильную трижды дистиллированную воду. Оценка образца может быть выполнена только в том случае, если все результаты контроля соответствуют ожиданиям.
Подробности критериев оценки
После ПЦР-амплификации образцы считаются отрицательными, если полоса нуклеиновой кислоты отсутствует или размер полосы находится за пределами позиции 738 п.н.; положительными, если определенная полоса нуклеиновой кислоты присутствует в позиции 738 п.н. Все положительные образцы должны быть секвенированы и подтверждены выравниванием с последовательностью 16S рРНК Eperythrozoon wenkelii в GenBank.
Спецификации подготовки реагентов
В Приложении А подробно описаны методы подготовки 13 реагентов, от лизоцима и SDS до буфера TAE и агарозного геля. Каждый реагент имеет определенную концентрацию, pH, условия стерилизации и требования к хранению для обеспечения постоянного качества.
Особое внимание следует уделить подготовке и использованию бромистого этидия (ЭБ). В связи с мутагенными свойствами препарата при работе с ним необходимо строго соблюдать протоколы биологической безопасности. Подготовка и использование должны осуществляться в специально отведенных зонах с использованием средств индивидуальной защиты.
Рекомендации по внедрению и контроль качества
Требования к лаборатории
Для внедрения настоящего стандарта необходимы базовые условия ПЦР-лаборатории, включая независимые функциональные зоны для обработки образцов, подготовки реагентов, амплификации и анализа продукта для предотвращения перекрестного загрязнения.
Точки контроля качества
Критические этапы контроля качества включают проверку качества праймеров, тестирование активности ферментов, калибровку температуры и целостность системы контроля. Лабораториям рекомендуется разработать стандартные рабочие процедуры и систему учета контроля качества.
Технологические обновления и усовершенствования
С развитием технологий молекулярной биологии лабораториям рекомендуется сосредоточиться на применении новых технологий, таких как количественная флуоресцентная ПЦР в реальном времени, в процессе внедрения, чтобы постоянно повышать чувствительность и специфичность обнаружения.
Прикладная ценность стандарта
Разработка и внедрение настоящего стандарта восполняет пробел в выявлении Eperythrozoon wenkelii у крупного рогатого скота в моей стране, обеспечивая надежную техническую поддержку для инспекции и карантинирования при въезде и выезде, мониторинга заболеваний животных, а также профилактики и контроля заболеваний на фермах. Благодаря стандартизации операций обеспечивается сопоставимость и точность результатов испытаний, что имеет большое значение для обеспечения здорового развития животноводства.
SN/T 2022-2007 История
- 2007 SN/T 2022-2007 Протокол полимеразной цепной реакции (ПЦР) на Eperythrozoon wenyoni
