ASTM D6974-20 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в процедурах фильтрации и культивирования жидкого топлива

Стандартный №: ASTM D6974-20
Дата публикации: 2020
Разместил: American Society for Testing and Materials (ASTM)
состояние: быть заменен
быть заменен: ASTM D6974-25
Последняя версия: ASTM D6974-25

сфера применения

Обзор стандарта и техническая база

ASTM D6974-20 определяет стандартизированный метод обнаружения и подсчета гетеротрофных бактерий (ГБК) и грибов в жидких топливах с кинематической вязкостью 24 мм²·с⁻¹ или менее с использованием мембранной фильтрации (МФ). Этот стандарт в первую очередь опирается на метод IP 385 и метод испытаний D5259, обеспечивая важную техническую основу для мониторинга микробного загрязнения топлива.

Принцип метода и область применения

Этот количественный метод использует технологию мембранной фильтрации для улавливания микроорганизмов из образцов топлива с помощью фильтрующей мембраны из полиэфирсульфона (ПЭС) или ацетата целлюлозы (АЦ) с размером пор 0,45 мкм. После фильтрации фильтр инкубируют на специальной питательной среде и подсчитывают количество колониеобразующих единиц (КОЕ) для количественной оценки степени микробного загрязнения.

Этот метод применим к широкому спектру жидких топлив с кинематической вязкостью 24 мм²·с⁻¹ или менее при температуре окружающей среды, включая дизельное топливо, авиационное топливо и другие среднедистиллятные топлива. Тест можно проводить как на месте, так и в лабораторных условиях, что обеспечивает высокую гибкость и адаптивность.

Основные требования к оборудованию и материалам

Тип оборудования	Требования к спецификации	Примечания
Фильтрующая мембрана	Размер пор 0,45 мкм, диаметр 47 мм	Предпочтительно использовать предварительно стерилизованную фильтрующую мембрану с сеткой
Фильтрующее устройство	Три варианта: тестовое устройство D6426, шприцевая фильтрация, вакуумная фильтрация	Выберите подходящий метод в соответствии с условиями на месте
Чашка Петри	Диаметр ≥50 Можно использовать имеющиеся в продаже предварительно инфузионные чашки Петри. Необходимо использовать питательные среды TSA (для бактерий) и MEA (для грибов). Уровень pH должен строго контролироваться в указанном диапазоне. Подробная процедура: Подготовка пробы: Образцы топлива необходимо пропустить через делительную воронку для удаления свободной воды, энергично встряхнуть в течение 30 секунд для равномерного распределения микроорганизмов, а затем дать им отстояться. Объём пробы следует корректировать в зависимости от ожидаемой концентрации микроорганизмов. Для повышения чувствительности определения рекомендуется фильтровать пробы объёмом 200 мл, 20 мл и 2 мл. Варианты фильтрации Стандарт предусматривает три метода фильтрации: Вариант A: использование испытательного аппарата D6426, подходящего для обработки партий в лабораторных условиях Вариант B: фильтрация с помощью шприца, удобная для работы на месте и быстрого тестирования Вариант C: вакуумная фильтрация, подходящая для рутинного лабораторного анализа Каждый метод включает три основных этапа: фильтрация топлива, промывка моющим средством и промывка раствором Рингера. Подготовка среды и условия культивирования Агар с солодовым экстрактом (MEA) Для культивирования грибков pH обычно доводят до 5,4 ± 0,2, но для подавления роста бактерий его можно довести до pH 3,5. Для дальнейшего подавления бактериального загрязнения в питательную среду можно добавить 0,1% раствор хлортетрациклина (1 мл/100 мл МЭА). Триптический соевый агар (ТСА) Для бактериального культивирования pH необходимо строго контролировать в диапазоне 7,3±0,3. pH необходимо проверить после приготовления; партии, не соответствующие требованиям, следует отбраковать и приготовить среду заново. Условия культивирования Стандартная температура инкубации составляет 25°C±2°C, время инкубации — 3 дня для ТСА и 5 дней для МЭА. Если температура системы отбора проб значительно выше стандартной температуры инкубации, для улучшения восстановления можно использовать условия инкубации, более близкие к температуре системы. Расчет и представление результатов Количество колоний рассчитывается по следующей формуле: N = CC × 1000 / V Где N - КОЕ·л⁻¹, CC - количество колоний, а V - объем отфильтрованного образца (мл). Если рост колоний не наблюдается, рассчитайте CC как 1 и сообщите Технические ограничения и меры предосторожности Этот метод имеет несколько важных ограничений: микробная агрегация может привести к занижению фактического количества; поврежденные клетки или медленно растущие микроорганизмы могут не образовывать видимые колонии в течение указанного времени; и селективность питательной среды может влиять на эффективность восстановления различных микроорганизмов. Этот метод рекомендуется как часть диагностической или технической программы мониторинга в сочетании с другими параметрами испытаний (такими как биомасса АТФ) для комплексной оценки микробного загрязнения топлива. Рекомендации по внедрению и передовой опыт Валидация метода Перед внедрением программы рутинного мониторинга следует провести валидацию метода, включающую: тестирование эффективности фильтрации, проверку пригодности питательной среды и обучение операторов. Для обеспечения надежности метода рекомендуется использовать образцы с положительным контролем. Контроль качества Каждая партия испытаний должна включать отрицательный контроль (стерильную воду или буфер) для мониторинга загрязнения в процессе эксплуатации. Стандартные штаммы следует регулярно использовать для проверки эффективности питательной среды и пригодности условий культивирования. Интерпретация данных Результаты микробного подсчета следует интерпретировать с учетом истории эксплуатации топливной системы, других показателей загрязнения и результатов осмотра на месте. Ценность результатов испытаний в одной точке времени ограничена, поэтому рекомендуется создать систему мониторинга тенденций. Эволюция стандарта и технологическое развитие Стандарт ASTM D6974 был первоначально опубликован в 2003 году. В издании 2020 года в основном пересмотрены спецификации материала мембраны фильтра, а также требования к смешиванию и времени выдержки образцов. По сравнению с предыдущими версиями, в текущей версии больше внимания уделяется гибкости и применимости метода, что позволяет корректировать рабочие параметры в соответствии с конкретными потребностями. С развитием технологий молекулярной биологии в будущем может появиться возможность сочетать методы культивирования с технологиями молекулярной детекции для обеспечения более комплексного решения для оценки микробного загрязнения. ASTM D6974-20 Ссылочный документ ASTM D1129 Стандартная терминология, касающаяся воды ASTM D1193 Стандартные спецификации для реагентной воды ASTM D4175 Стандартная терминология, касающаяся нефтепродуктов, жидкого топлива и смазочных материалов， 2024-07-01 Обновление ASTM D5259 Стандартный метод тестирования для выделения и подсчета энтерококков из воды методом мембранного фильтра ASTM D6426 Стандартный метод определения фильтруемости дистиллятных мазутов ASTM D6469 Стандартное руководство по микробному загрязнению топлива и топливных систем ASTM D7463 Стандартный метод определения содержания аденозинтрифосфата (АТФ) в микроорганизмах в топливе, топливно-водных смесях и топливной воде， 2025-04-01 Обновление ASTM D7464 Стандартная практика ручного отбора проб жидкого топлива, связанных материалов и компонентов топливной системы для микробиологического тестирования， 2025-07-01 Обновление ASTM E1326 Стандартное руководство по оценке нетрадиционных микробиологических тестов, используемых для подсчета бактерий ASTM F1094 Стандартные методы испытаний микробиологического мониторинга воды, используемой для обработки электронных и микроэлектронных устройств, с помощью крана-отборника прямого давления и методом предварительно стерилизованных пластиковых пакетов ASTM D6974-20 История 2025 ASTM D6974-25 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибков в жидких топливах — процедуры фильтрации и культивирования 2020 ASTM D6974-20 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в процедурах фильтрации и культивирования жидкого топлива 2016 ASTM D6974-16 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе, процедуры фильтрации и культивирования, 2014 г. 2009 ASTM D6974-09(2013)e2 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе — процедуры фильтрации и культивирования 2009 ASTM D6974-09(2013)e1 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе: процедуры фильтрации и культивирования 2009 ASTM D6974-09(2013) Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе: процедуры фильтрации и культивирования 2009 ASTM D6974-09 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе8212; Процедуры фильтрации и культивирования 2004 ASTM D6974-04 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе8212; Процедуры фильтрации и культивирования 2003 ASTM D6974-03 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в процедурах фильтрации и культивирования жидкого топлива Специальные темы по стандартам и нормам Стерильный фильтр-инкубатор Среда для культивирования спор грибов бактерии грибковой культуры Процедура бактериального культивирования Методы жидкой культуры грибов Индустрия бактериальных культур жидкостей организма жидкая культура грибов жидкая культура грибов жидкая культура грибов стандарты и спецификации ASTM D6974-03 практика* подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в процедурах фильтрации и культивирования жидкого топлива ASTM D6974-16 практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе, процедуры фильтрации и культивирования, 2014 г. ASTM D6974-09(2013)e1 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе: процедуры фильтрации и культивирования ASTM D6974-09(2013)e2 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе — процедуры фильтрации и культивирования SANS 9308-1:2004 Качество воды. Обнаружение и подсчет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть 1. Метод мембранной фильтрации ASTM D6974-09(2013 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе: процедуры фильтрации и культивирования BS EN ISO 9308-1:2000 Качество воды - Обнаружение и подсчет кишечной палочки и колиформных бактерий - Метод мембранной фильтрации ISO 9308-1:2000 Качество воды. Обнаружение и подсчет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть 1. Метод мембранной фильтрации ASTM D6974-09 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе8212; Процедуры фильтрации и культивирования © 2025. Все права защищены.

Тип оборудования

Требования к спецификации

Примечания

Фильтрующая мембрана

Размер пор 0,45 мкм, диаметр 47 мм

Предпочтительно использовать предварительно стерилизованную фильтрующую мембрану с сеткой

Фильтрующее устройство

Три варианта: тестовое устройство D6426, шприцевая фильтрация, вакуумная фильтрация

Выберите подходящий метод в соответствии с условиями на месте

Чашка Петри

Диаметр ≥50 Можно использовать имеющиеся в продаже предварительно инфузионные чашки Петри. Необходимо использовать питательные среды TSA (для бактерий) и MEA (для грибов). Уровень pH должен строго контролироваться в указанном диапазоне. Подробная процедура: Подготовка пробы: Образцы топлива необходимо пропустить через делительную воронку для удаления свободной воды, энергично встряхнуть в течение 30 секунд для равномерного распределения микроорганизмов, а затем дать им отстояться. Объём пробы следует корректировать в зависимости от ожидаемой концентрации микроорганизмов. Для повышения чувствительности определения рекомендуется фильтровать пробы объёмом 200 мл, 20 мл и 2 мл.

Варианты фильтрации

Стандарт предусматривает три метода фильтрации:

Вариант A: использование испытательного аппарата D6426, подходящего для обработки партий в лабораторных условиях

Вариант B: фильтрация с помощью шприца, удобная для работы на месте и быстрого тестирования

Вариант C: вакуумная фильтрация, подходящая для рутинного лабораторного анализа

Каждый метод включает три основных этапа: фильтрация топлива, промывка моющим средством и промывка раствором Рингера.

Подготовка среды и условия культивирования

Агар с солодовым экстрактом (MEA)

Для культивирования грибков pH обычно доводят до 5,4 ± 0,2, но для подавления роста бактерий его можно довести до pH 3,5. Для дальнейшего подавления бактериального загрязнения в питательную среду можно добавить 0,1% раствор хлортетрациклина (1 мл/100 мл МЭА).

Триптический соевый агар (ТСА)

Для бактериального культивирования pH необходимо строго контролировать в диапазоне 7,3±0,3. pH необходимо проверить после приготовления; партии, не соответствующие требованиям, следует отбраковать и приготовить среду заново.

Условия культивирования

Стандартная температура инкубации составляет 25°C±2°C, время инкубации — 3 дня для ТСА и 5 дней для МЭА. Если температура системы отбора проб значительно выше стандартной температуры инкубации, для улучшения восстановления можно использовать условия инкубации, более близкие к температуре системы.

Расчет и представление результатов

Количество колоний рассчитывается по следующей формуле:

N = CC × 1000 / V

Где N - КОЕ·л⁻¹, CC - количество колоний, а V - объем отфильтрованного образца (мл). Если рост колоний не наблюдается, рассчитайте CC как 1 и сообщите

Технические ограничения и меры предосторожности

Этот метод имеет несколько важных ограничений: микробная агрегация может привести к занижению фактического количества; поврежденные клетки или медленно растущие микроорганизмы могут не образовывать видимые колонии в течение указанного времени; и селективность питательной среды может влиять на эффективность восстановления различных микроорганизмов.

Этот метод рекомендуется как часть диагностической или технической программы мониторинга в сочетании с другими параметрами испытаний (такими как биомасса АТФ) для комплексной оценки микробного загрязнения топлива.

Эволюция стандарта и технологическое развитие

Стандарт ASTM D6974 был первоначально опубликован в 2003 году. В издании 2020 года в основном пересмотрены спецификации материала мембраны фильтра, а также требования к смешиванию и времени выдержки образцов. По сравнению с предыдущими версиями, в текущей версии больше внимания уделяется гибкости и применимости метода, что позволяет корректировать рабочие параметры в соответствии с конкретными потребностями.

С развитием технологий молекулярной биологии в будущем может появиться возможность сочетать методы культивирования с технологиями молекулярной детекции для обеспечения более комплексного решения для оценки микробного загрязнения.

ASTM D6974-20 Ссылочный документ

ASTM D1129 Стандартная терминология, касающаяся воды
ASTM D1193 Стандартные спецификации для реагентной воды
ASTM D4175 Стандартная терминология, касающаяся нефтепродуктов, жидкого топлива и смазочных материалов*， 2024-07-01 Обновление
ASTM D5259 Стандартный метод тестирования для выделения и подсчета энтерококков из воды методом мембранного фильтра
ASTM D6426 Стандартный метод определения фильтруемости дистиллятных мазутов
ASTM D6469 Стандартное руководство по микробному загрязнению топлива и топливных систем
ASTM D7463 Стандартный метод определения содержания аденозинтрифосфата (АТФ) в микроорганизмах в топливе, топливно-водных смесях и топливной воде*， 2025-04-01 Обновление
ASTM D7464 Стандартная практика ручного отбора проб жидкого топлива, связанных материалов и компонентов топливной системы для микробиологического тестирования*， 2025-07-01 Обновление
ASTM E1326 Стандартное руководство по оценке нетрадиционных микробиологических тестов, используемых для подсчета бактерий
ASTM F1094 Стандартные методы испытаний микробиологического мониторинга воды, используемой для обработки электронных и микроэлектронных устройств, с помощью крана-отборника прямого давления и методом предварительно стерилизованных пластиковых пакетов

ASTM D6974-20 История

2025 ASTM D6974-25 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибков в жидких топливах — процедуры фильтрации и культивирования
2020 ASTM D6974-20 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в процедурах фильтрации и культивирования жидкого топлива
2016 ASTM D6974-16 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе, процедуры фильтрации и культивирования, 2014 г.
2009 ASTM D6974-09(2013)e2 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе — процедуры фильтрации и культивирования
2009 ASTM D6974-09(2013)e1 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе: процедуры фильтрации и культивирования
2009 ASTM D6974-09(2013) Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе: процедуры фильтрации и культивирования
2009 ASTM D6974-09 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе8212; Процедуры фильтрации и культивирования
2004 ASTM D6974-04 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе8212; Процедуры фильтрации и культивирования
2003 ASTM D6974-03 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в процедурах фильтрации и культивирования жидкого топлива

Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в процедурах фильтрации и культивирования жидкого топлива

Специальные темы по стандартам и нормам

Стерильный фильтр-инкубатор Среда для культивирования спор грибов бактерии грибковой культуры Процедура бактериального культивирования Методы жидкой культуры грибов Индустрия бактериальных культур жидкостей организма жидкая культура грибов жидкая культура грибов жидкая культура грибов

стандарты и спецификации

ASTM D6974-03 практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в процедурах фильтрации и культивирования жидкого топлива ASTM D6974-16 практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе, процедуры фильтрации и культивирования, 2014 г. ASTM D6974-09(2013)e1 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе: процедуры фильтрации и культивирования ASTM D6974-09(2013)e2 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе — процедуры фильтрации и культивирования SANS 9308-1:2004 Качество воды. Обнаружение и подсчет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть 1. Метод мембранной фильтрации ASTM D6974-09(2013 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе: процедуры фильтрации и культивирования BS EN ISO 9308-1:2000 Качество воды - Обнаружение и подсчет кишечной палочки и колиформных бактерий - Метод мембранной фильтрации ISO 9308-1:2000 Качество воды. Обнаружение и подсчет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть 1. Метод мембранной фильтрации ASTM D6974-09 Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в жидком топливе8212; Процедуры фильтрации и культивирования

ASTM D6974-20Стандартная практика подсчета жизнеспособных бактерий и грибов в процедурах фильтрации и культивирования жидкого топлива