T/CSBM 0044-2023 Неантителозависимый метод магнитной сепарации обнаружения циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови. (Англоязычная версия)
Принцип метода 4.1. Основываясь на характерных различиях между ЦОК и клетками крови, используйте неантителозависимые методы для захвата ЦОК и анализа захваченных клеток посредством окрашивания клеток, иммуноцитохимии, флуоресцентной гибридизации in situ или полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. 4.2 Независимые от антител методы включают метод захвата с помощью зонда без метки (см. 9.2.1), метод зонда с захватом пептида (см. 9.2.2), метод мембранной фильтрации (см. Приложение C) и метод микрофлюидного чипа (см. Приложение D). . Независимые от антител методы магнитной сепарации включают, помимо прочего, следующие два метода:
——Метод захвата без метки: после разделения ЦОК под действием центробежной силы в среде с определенным градиентом плотности ЦОК захватываются с использованием немеченых парамагнитных наномагнитных частиц. А под действием внешнего магнитного поля ЦОК могут быть эффективно отделены и обогащены от других компонентов крови — — Метод зонда захвата полипептидов: использование модифицированных пептидами магнитных частиц для захвата ЦОК в периферической крови, а также зондов захвата пептидов и ЦОК в периферической крови; периферическая кровь. Стабильное связывание, эффективное отделение и обогащение ЦОК от других компонентов крови под действием внешнего магнитного поля. 5 Условия испытаний Условия испытаний следующие:
——Температура: 25 ℃ ± 5 ℃ - Относительная влажность: 30% ~ 65% - Давление: стандартное атмосферное давление; 6 Реагентные материалы, приборы и оборудование Реагентные материалы, приборы и оборудование должны соответствовать требованиям приложения А. 7 Процесс обнаружения 7.1 Процесс обнаружения ЦОК в периферической крови показан на рисунке 1. 7.2 См. Приложение B для получения информации о работе обнаружения магнитной сепарации CTC. 8 Подготовка проб 8.1 Отбор проб крови 8.1.1 Перед взятием крови подготовьте вакуумные антикоагулянтные пробирки с гепарином/ЭДТА-К2. 8.1.2 Объем взятой крови должен составлять от 4 до 15 мл. После взятия крови пробирку для взятия крови следует немедленно перевернуть и перемешать не менее 5 раз. Не должно происходить сильного встряхивания, приводящего к образованию пузырьков. 8.1.3 Образцы крови следует хранить при температуре 4 ℃ ~ 8 ℃, а обнаружение ЦОК следует проводить в течение 72 часов. 8.2 Предварительная обработка пробы 8.2.1 Метод центрифугирования в градиенте плотности 8.2.1.1 Проверьте пробу крови перед центрифугированием. Если нет гемолиза или сгустков, это годный образец. 8.2.1.2 Поместите раствор для разделения градиента плотности клеток на водяную баню с температурой 37°C для предварительного нагрева в течение 15 минут. Уровень воды в водяной бане должен быть выше уровня жидкости пробы, чтобы проба в контейнере достигла целевой температуры. 8.2.1.3 После предварительного нагрева добавьте его в центрифужную пробирку вместимостью 15 мл. 8.2.1.4 Возьмите пробирку для взятия крови за оба конца, осторожно поверните пробирку для взятия крови на 180° 8–10 раз и тщательно перемешайте пробу периферической крови. 8.2.1.5 Отбирают 1 мл смешанной пробы крови, разбавляют ее добавлением 3 мл 1×PBS в соотношении 1:3 и медленно добавляют пипеткой разбавленную кровь к верхнему слою раствора для разделения в градиенте плотности. Примечание. PBS — это физиологический раствор с фосфатным буфером. 8.2.1.6 Поместите в центрифугу при 400–450 г и центрифугируйте в течение 30–40 мин. 8.2.1.7 После центрифугирования граница слоев становится прозрачной. После центрифугирования раствор разделяется на 3 слоя: верхний слой представляет собой слой плазмы, средний слой представляет собой слой лейкоцитной пленки и нижний слой представляет собой слой эритроцитов. . Средний слой представляет собой слой сбора клеток-мишеней. В середине слоя клеток-мишеней находится полоса белой пленки, состоящая в основном из мононуклеаров. Уровень перехвата клеток-мишеней составляет> 85%. 8.2.1.8 После удаления верхней плазмы пипеткой перенесите весь средний слой сбора клеток-мишеней (от 2,5 до 6,5 мл) в центрифужную пробирку емкостью 15 мл, добавьте PBS и доведите объем до 12 мл, плотно закройте крышку пробирки. и осторожно переверните центрифужную пробирку несколько раз на 180°, поместите ее в центрифугу при 300–350 г и центрифугируйте в течение 5–7 мин. 8.2.1.9 После центрифугирования оставляют на дне около 100 г жидкости. Добавьте соответствующее количество PBS, чтобы ресуспендировать клетки. 8.2.2 Метод лизиса эритроцитов 8.2.2.1 Отбор проб: Метод следует проводить при температуре 4°C. Возьмите 1 мл свежей антикоагулянтной крови в центрифужную пробирку. 8.2.2.2 Лизис: Добавьте 3 мл 1× буфера для лизиса эритроцитов в центрифужную пробирку в соотношении 1:3 и лизируйте в течение 5 минут. 8.2.2.3 Центрифуга: Центрифугируйте при 500 g в течение 5 минут при комнатной температуре и отбросьте красный супернатант. 8.2.2.4 Вторичный лизис и центрифугирование: Если обнаружено, что эритроциты лизированы не полностью, лизис (см. 8.2.2.2) и центрифугирование (см. 8.2.2.3) можно повторить один раз. 8.2.2.5 Промывание: Добавьте необходимое количество 1×PBS, осторожно перемешайте, ресуспендируйте осадок и центрифугируйте при 500 g в течение 5 минут при комнатной температуре. 8.2.2.6 Осаждение: После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте выпавшие клетки в соответствующем количестве 1×PBS. 9 Тестирование проб 9.1 Подготовка к тесту 9.1.1 Активация зонда захвата CTC и оценка дисперсии 9.1.1.1 Зажмите стенку пробирки пинцетом, наклоните центрифужную пробирку на 45°, включите ультразвуковой очиститель, энергично встряхните из стороны в сторону и удерживайте в течение более 1 минуты. 9.1.1.2 Возьмите 2 мкл активированного зонда захвата CTC и равномерно распределите его по предметному стеклу. Под невооруженным глазом не должно быть видимых осадков или хлопьев. 9.1.1.3 При необходимости наблюдать под микроскопом. Необходимо, чтобы раствор был равномерно диспергирован на мелкие частицы, взвешенные в дисперсионной среде, без седиментации или агломерации. Активация зонда захвата CTC завершена. Примечание 1. Активация — это процесс, который уменьшает агломерацию материала, увеличивает реакционную способность материала и осуществляет химическую обработку материалов для улучшения дисперсии материала. Примечание 2: Дисперсность означает способность материала равномерно диспергироваться на мелкие частицы, суспендированные в дисперсионной среде, без осаждения в воде или других однородных жидких средах. Примечание 3: Оценка дисперсии подразумевает использование ультразвукового очистителя для полного диспергирования зонда с помощью ультразвукового очистителя и взятие небольшого количества для определения распределения частиц зонда по размерам с помощью анализатора размера частиц. Индекс полидисперсности (PDI) ≤ 0,3 указывает на хорошее. дисперсия. 9.1.......
T/CSBM 0044-2023 История
2023T/CSBM 0044-2023 Неантителозависимый метод магнитной сепарации обнаружения циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови.