T/CI 011-2021
Технические рекомендации по выращиванию, наблюдению и оценке лекарственной устойчивости бактериальной биопленки (Англоязычная версия)

Стандартный №

T/CI 011-2021

язык

Китайский, Доступно на английском

Дата публикации

2021

Разместил

Group Standards of the People's Republic of China

состояние

быть заменен 2022-03

быть заменен

T/CI 011-2022

Последняя версия

T/CI 011-2023

сфера применения

Методы и технические стандарты культуры бактериальных биопленок Следующие методы и технические стандарты культуры биопленок написаны с использованием Pseudomonas aeruginosa в качестве модельного штамма.Культивирование и условия эксперимента других видов бактерий могут быть соответствующим образом скорректированы в соответствии с потребностями. Pseudomonas aeruginosa — распространенный грамотрицательный условно-патогенный микроорганизм, широко распространенный в нормальной коже человека, дыхательных путях, кишечнике и различных природных средах, таких как вода и почва. Эта бактерия имеет палочковидную форму с одним жгутиком, подходящая температура роста составляет 25-37° C. Она также может расти при 42° C. На среде LB она выглядит как зеленая круглая колония и может легко прикрепляться к поверхности. различных субстратов с образованием биопленки. Pseudomonas aeruginosa — одна из основных бактерий-возбудителей внутрибольничных инфекций. Она может образовывать биопленки на различных частях тела у пациентов со сниженным иммунитетом и вызывать длительные хронические инфекции, в том числе ожоговые раневые инфекции, инфекции дыхательных путей и мочевыводящих путей. Фатальные осложнения, такие как бактериемия и сепсис. Эта бактерия устойчива к множеству антибиотиков, а механизм устойчивости очень сложен, включая образование биопленок, усиление системы откачивающего насоса, изменение проницаемости клеточных мембран и мишеней лекарств, а также секрецию антибактериальных ферментов. Механизм формирования биопленки Pseudomonas aeruginosa также довольно сложен, например, за счет избыточной секреции внеклеточных полисахаридов, накопления внеклеточной ДНК, снижения подвижности, регуляции системы кворума и т. д. В качестве модельного штамма для изучения биопленок Pseudomonas aeruginosa уже давно широко используется в исследованиях по конструированию биопленок, выявлению лекарственной устойчивости и разработке схем лечения. Настоящее руководство написано с использованием Pseudomonas aeruginosa в качестве модельного штамма. Культура и экспериментальные условия других бактериальных штаммов могут быть скорректированы соответствующим образом по мере необходимости для достижения наилучших экспериментальных результатов. 4.1 Статическое культивирование биопленок in vitro В этом руководстве рассматриваются четыре широко используемых метода статического культивирования биопленок in vitro, включая метод культивирования в луночном планшете, метод культивирования на стеклянных шариках, метод культивирования на предметном стекле и метод культивирования на колышковой крышке. (1) Метод культуры луночного планшета (4.1.1) Культивируют разбавленный бактериальный раствор в 96-луночном планшете или 24-луночном планшете. Биопленка прилипает к стенкам лунки. Удалите суспензию и элюируйте планктонные бактерии для получения биопленки. , в последующих экспериментах. Метод культивирования в луночных планшетах обычно используется для проверки способности бактериальных штаммов к образованию биопленок, количественного определения биопленок, устойчивости биопленок и минимальной ингибирующей концентрации лекарств. Этот метод культивирования можно комбинировать с различными методами окрашивания для количественного определения биопленок, а структуры культивируемых биопленок можно наблюдать с помощью различных микроскопов. Этот метод культивирования имеет преимущества: высокая производительность, короткое время культивирования и простота эксплуатации.Однако толщина и твердость культивируемой биопленки невелики, а планктонные бактерии нелегко элюировать, что приводит к большим различиям между параллелями. (2) Метод культивирования стеклянных шариков (4.1.2) Поместите стеклянные шарики в разбавленный бактериальный раствор в 24-луночный планшет и культивируйте их. Биопленка прилипает к поверхности стеклянных шариков. Плавающие бактерии можно элюировать для получения биопленку для последующих экспериментов. Этот метод культивирования аналогичен методу культивирования в луночном планшете и обычно используется для проверки способности бактериальных штаммов к образованию биопленок, количественного определения биопленок, устойчивости биопленок и минимальной ингибирующей концентрации лекарств. Этот метод культивирования можно комбинировать с различными методами окрашивания для количественного определения биопленки, но его нелегко наблюдать под микроскопом. Этот метод культивирования имеет преимущества высокой производительности и короткого времени культивирования, но операция немного сложна. Толщина и твердость биопленки, культивируемой этим методом, выше, планктонные бактерии легче очищаются, а разница между параллелями невелика. (3) Метод культивирования на предметном стекле (4.1.3) Вставьте предметное стекло в бактериальную жидкость для культивирования, биопленка прилипнет к поверхности предметного стекла. Удалите пикер и элюируйте планктонные бактерии, чтобы получить биопленку для последующих экспериментов. Этот метод обычно используется для обнаружения способности бактериальных штаммов к образованию биопленок и наблюдения за структурой и морфологией биопленок. Его можно использовать в сочетании с различными методами окрашивания и различными микроскопами для наблюдения за конфигурацией биопленок. Этот метод имеет высокую производительность и короткое время инкубации, но операция несколько сложна. Количество биопленки, культивируемой этим методом, велико, ее толщина и твердость высоки, планктонные бактерии легко очищаются, а разница между параллелями невелика. (4) Метод культивирования с колышковой крышкой (4.1.4) Поместите крышку 96-луночного планшета приподнятым клином (штифтом) в 96-луночный планшет, содержащий бактериальную жидкость для культуры. Биопленку прикрепляют к среднему и нижнему концам колышек. Удалите его. Накройте и смойте планктонные клетки на колышке, чтобы получить биопленку для последующих экспериментов. Этот метод аналогичен методу культивирования в луночном планшете и обычно используется для проверки способности бактериальных штаммов образовывать биопленки, количественного определения биопленок, устойчивости биопленок и минимальной ингибирующей концентрации лекарств. Этот метод культивирования можно комбинировать с различными методами окрашивания для количественного определения биопленок, но культивированные биопленки нелегко наблюдать под микроскопом, поскольку они находятся на вершине клина. Этот метод культивирования имеет преимущества, заключающиеся в высокой производительности, коротком времени культивирования и простоте эксплуатации: толщина и твердость культивируемой биопленки выше, планктонные бактерии легче элюируются, а различия между параллелями невелики. Подробная информация о каждой культуре и методе наблюдения представлена ниже. 4.1.1 Область применения метода культивирования на луночном планшете: Метод культивирования биопленки на луночном планшете обычно подходит для следующих сценариев: (1) Необходимо обнаружить способность к образованию биопленок между различными штаммами (дикими штаммами и мутантными штаммами). , (2) Необходимо выявить чувствительность/толерантность различных штаммов к препаратам в состоянии биопленки. Методы анализа биопленок, культивируемых в луночных планшетах, в основном включают: количественную оценку биопленки (глава 5.1.2a), устойчивость биопленки и минимальную ингибирующую концентрацию лекарств (глава 6.1). Следующие схематические устройства и операции основаны на Pseudomonas aeruginosa (PA) в качестве модельного штамма и выполняются в аэробных условиях культивирования: Рисунок 1. Метод статического культивирования биопленок in vitro (метод культивирования в луночных планшетах) 4.1.1.1 Экспериментальные материалы: a. стерильный 96-луночный планшет (или 24-луночный планшет Nest/Corning); b. стерильный резервуар; c. пипетка-пистолет объемом 100 мкл (или 1 мл). пипетка); d. стерильная шейкерная пробирка на 15 мл; e. наконечник пипетки на 100 мкл (или 1 мл); f. среда LB (в соответствии с g. необходимыми штаммами; h. ведро для отходов; i. 75% спирт; j. стерильный ddH2O; k. стерильный физиологический раствор. 4.1.1.2 Этапы культивирования [В приложении подробно описаны режимы протокола/СОП] Сначала инокулируют целевой штамм в среду LB и культивируют в течение ночи. В таблице асептических операций используйте свежую культуральную среду для разведения бактериального раствора в определенной пропорции, затем вылейте разбавленный бактериальный раствор в резервуар со стерильной жидкостью, а затем добавьте разбавленный бактериальный раствор в 96-луночный планшет или 24-луночный планшет. с помощью пипетки-пистолета с рядными лунками и помещенными при желаемой температуре для выращивания биопленок. Экспериментальные штаммы и контрольные штаммы инокулировали и культивировали в соответствии с этапами культивирования, указанными в Приложении Xa (Приложение Xa), а затем анализировали биопленку (Глава 5). 4.1.1.3 Технические моменты а. Все операции должны строго соблюдаться в асептическом рабочем процессе. Во время операции необходимо использовать стерилизованное оборудование и использовать спирт для дезинфекции операционного стола и используемого оборудования во избежание перекрестного загрязнения. ; b. Перед добавлением бактериального раствора в диафрагму осторожно встряхните резервуар с жидкостью, чтобы равномерно перемешать бактериальный раствор, и несколько раз осторожно продуйте бактериальный раствор с помощью рядного пистолета, чтобы уменьшить экспериментальную ошибку; c. Объем Оставшаяся бактериальная жидкость в основном такая же, а диафрагму следует закрыть воздухопроницаемой герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить испарение жидкости во время культивирования; г. При удалении отработанной жидкости и очистке биопленки будьте осторожны, не прикасайтесь к биопленке кончик пипетки, чтобы убедиться в целостности биопленки пола. 4.1.2 Область применения метода культуры стеклянных шариков: метод культуры биопленок стеклянными шариками обычно применим к следующим сценариям: (1) используется для циклического культивирования биопленок для эволюционных экспериментов в условиях давления, (2) необходимо обнаружить Влияние различных штаммов на биопленки в состоянии биопленок Лекарственная чувствительность/переносимость. Метод анализа биопленки, культивированной на стеклянных шариках, в основном: метод подсчета КОЕ (раздел 5.3.2b). Следующие схематические устройства и операции основаны на Pseudomonas aeruginosa (PA) в качестве модельного штамма и выполняются в аэробных условиях культивирования: Рисунок 2. Метод статического культивирования биопленок in vitro (метод культивирования стеклянных шариков) 4.1.2.1 Экспериментальные материалы: a. стерильный 24-луночный планшет; b. стерильный резервуар; c. пипетка на 1 мл d. стерильная шейкерная пробирка на 15 мл; e. наконечник пипетки на 1 мл. е. среда LB (при необходимости можно использовать другие среды); ж. стерильная ddH2O (при необходимости можно использовать раствор PBS или физиологический раствор); h. желаемый штамм; i. ведро для отходов; к. спирт 75% к. пинцет л. стеклянные бусины 3-5 мм. 4.1.2.2 Этапы культивирования [Подробно описано в приложении в режиме протокола/СОП] Сначала инокулируют целевой штамм в среду LB и культивируют в течение ночи, затем разбавляют бактериальный раствор в определенной пропорции свежей средой, а затем инокулируют разбавленный бактериальный раствор Переносят в лунки 24-луночного планшета, добавляют две стерильные стеклянные шарики и культивируют в течение ночи при 37°C при встряхивании со скоростью 100 об/мин. Экспериментальные штаммы и контрольные штаммы инокулировали и культивировали в соответствии с этапами культивирования, указанными в Приложении Xa (Приложение Xb), а затем анализировали биопленку (Глава 5). 4.1.2.3 Технические моменты а. Все операции должны строго соблюдаться в асептическом рабочем процессе. Во время операции необходимо использовать стерилизованное оборудование и использовать спирт для дезинфекции операционного стола и используемого оборудования во избежание перекрестного загрязнения. ; b. Перед добавлением бактериальной жидкости в луночный планшет осторожно встряхните резервуар с жидкостью, чтобы равномерно перемешать бактериальную жидкость, и с помощью пипетки аккуратно перекачайте бактериальную жидкость несколько раз, чтобы уменьшить экспериментальные ошибки; c. Не должно быть слишком во избежание попадания большого количества бактериальной жидкости в отверстие Бактериальная жидкость выплескивается во время встряхивания культуры, что может вызвать перекрестное заражение; d.При переносе стеклянных шариков стерильным пинцетом необходимо минимизировать поверхность контакта между пинцетом и стеклянными шариками, чтобы обеспечить целостность биопленки; биопленка культуры в пластинке с отверстием. Необходимо обеспечить, чтобы объем оставшейся бактериальной жидкости в отверстии после культивирования был в основном одинаковым, а пластина с отверстием должна быть закрыта воздухопроницаемой герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить жидкости от испарения во время культивирования. 4.1.3 Область применения метода культуры на предметном стекле: Метод культуры биопленки на стекле обычно подходит для следующих сценариев: (1) необходимо обнаружить способность к образованию биопленок между различными штаммами (дикими штаммами и мутантными штаммами), ( 2) Необходимо выявить чувствительность/толерантность различных штаммов к препаратам в состоянии биопленки. Методы анализа биопленок, культивируемых на предметных стеклах, в основном включают: количественный анализ биопленок (раздел 5.1.2c) и устойчивость биопленок (раздел 5.3.2c). Следующие схематические устройства и операции проиллюстрированы с использованием Pseudomonas aeruginosa (PA) в качестве модельного штамма в условиях аэробного культивирования: Рисунок 3. Метод статического культивирования биопленок in vitro (метод культивирования на предметных стеклах) 4.1.3.1 Экспериментальные материалы: а. Стерильные. чашка Петри (для статического культивирования требуется 6-луночный планшет); b. стерильная встряхиваемая пробирка емкостью 15 мл; c. культуральная среда LB (при необходимости можно использовать и другие культуральные среды); d. стерильная ddH2O (раствор PBS или физиологический раствор). можно использовать по мере необходимости) д. Требуемый бактериальный штамм е. Ведро для отходов г. 75% спирт г. Пинцет я. Скольжения. 4.1.3.2 Этапы культивирования [Приложение подробно объяснено в режиме протокола/СОП] Сначала инокулируют целевой штамм в среду LB и культивируют его в течение ночи, разбавляют бактериальную жидкость в определенной пропорции свежей средой и затем добавляют разбавленную бактериальную жидкость. Переносят в чашку Петри, добавляют стерильные предметные стекла, встряхивают при 37°C и 100 об/мин и культивируют в течение ночи. Как экспериментальные, так и контрольные штаммы инокулировали и культивировали в соответствии с процедурами культивирования, указанными в Приложении Xa (Приложение Xc), а затем анализировали биопленку (Глава 5). 4.1.3.3 Технические моменты a. Все операции должны строго соблюдаться в асептических рабочих процедурах. Во время операции обращайте внимание на использование стерилизующего оборудования и используйте спирт для дезинфекции операционного стола и используемого оборудования во избежание перекрестного загрязнения; б. В чашке Петри не должно быть слишком много бактериальной жидкости, чтобы избежать загрязнения, вызванного разбрызгиванием бактериальной жидкости при встряхивании культуры; в. При использовании стерильного пинцета для переноса предметного стекла необходимо минимизировать поверхность контакта между пинцет и стеклянные шарики, чтобы обеспечить целостность биопленки; г. При встряхивании и культивировании культуральную чашку следует закрывать воздухопроницаемой герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить испарение жидкости. 4.1.4 Область применения метода культуры биопленки с крышкой: Метод культуры биопленки с крышкой обычно подходит для следующих сценариев: (1) необходимо обнаружить способность к образованию биопленок между различными штаммами (дикими штаммами и мутантными штаммами); (2) Необходимо проверить чувствительность/толерантность различных штаммов к препаратам в состоянии биопленки. Методы анализа биопленок, культивированных на Peg-крышке, в основном включают: количественную оценку биопленки (глава 5.1.2c) и устойчивость биопленки (глава 5.3.2c). Следующие схематические устройства и операции выполняются с использованием Pseudomonas aeruginosa (PA) в качестве модельного штамма и в условиях аэробного культивирования: Рисунок 4. Метод статического культивирования биопленок in vitro (метод культивирования с помощью крышки) 4.1.4.1 Экспериментальные материалы: a. 96-луночный планшет, b. крышка Peg (см. рисунок 3 в Приложении), c. резервуар для стерильной жидкости, d. пипетка на 100 мкл, e. стерильная встряхиваемая пробирка на 15 мл. f. Наконечник пипетки объемом 100 мкл (или 1 мл) g. Среда LB (при необходимости можно использовать другие среды) h. Требуемые штаммы i. Бочка для отработанной жидкости j.  75% спирта k.Стерильный ddH2O (при необходимости можно использовать раствор PBS или физиологический раствор) l.Стерильный физиологический рассол. 4.1.4.2 Этапы культивирования [Приложение подробно объяснено в режиме протокола/СОП] Сначала инокулируют целевой штамм в среду LB и культивируют его в течение ночи, разбавляют бактериальную жидкость в определенной пропорции свежей средой и затем добавьте разбавленную бактериальную жидкость. Перенесите в 96-луночный планшет и осторожно закройте крышку бактериальным раствором. Встряхивайте при температуре 37°C и 100 об/мин на ночь. Как экспериментальный, так и контрольный штамм инокулировали и культивировали в соответствии с процедурами культивирования, указанными в Приложении Xa (Приложение Xd), а затем анализировали биопленку (Глава 5). 4.1.4.3 Технические моменты а. Все операции должны строго соблюдаться в асептических рабочих процедурах. Во время операции обращайте внимание на использование стерилизующего оборудования и используйте спирт для дезинфекции операционного стола и используемого оборудования во избежание перекрестного загрязнения; б. Перед добавлением бактериальной жидкости в луночный планшет осторожно встряхните резервуар с жидкостью, чтобы равномерно перемешать бактериальную жидкость, и несколько раз осторожно продуйте бактериальную жидкость из залпового пистолета, чтобы уменьшить экспериментальные ошибки; в. Не должно быть слишком в лунку попадает много бактериальной жидкости, чтобы избежать попадания контаминации, вызванной разбрызгиванием бактериальной жидкости при закрытии крышки или встряхивании культуры; г. Необходимо убедиться, что объем оставшейся бактериальной жидкости в лунках после культивирования в основном одинаков, и луночный планшет должен быть закрыт воздухопроницаемой герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить испарение жидкости во время культивирования, например, перемещение. 4.2. Динамическая культура биопленки in vitro. В этом руководстве рассматриваются два широко используемых метода статической культуры биопленки in vitro, включая метод культивирования в пробирке и метод культивирования в бассейне. Подробности следующие: (1) В методе культивирования в пробирке бактериальный раствор вводится после выдерживания в силиконовую трубку и прикрепив ее, культуральную среду впрыскивают в силиконовую трубку с постоянной скоростью, биопленку культивируют в потоке, и биопленку прикрепляют к стенке трубки. Этот метод обычно используется в экспериментах с большой потребностью в образцах биопленок, таких как сбор образцов биопленок, сбор экзополисахаридов и биотрансформация и т. Д. Этот метод может образовывать большое количество биопленки. Структура биопленки толстая, а поток высокий. Однако время культивирования велико, а операция сложна. Нелегко наблюдать структуру биопленки с помощью микроскопа. (2) Метод культивирования в бассейне: введите бактериальный раствор в канал культурального пула, переверните его и дайте постоять, пока бактерии не прикрепятся к крышке, затем введите культуральную среду в культуральный канал с постоянной скоростью и культивируйте. биопленка течет.Биопленка прилипает к оболочке трехканального пула. Этот метод обычно используется в таких экспериментах, как наблюдение за морфологией биопленки и влиянием лекарств на морфологию биопленки. Этот метод формирует полную морфологию и структуру биопленки. Его можно комбинировать с флуоресцентно меченными штаммами или различными методами окрашивания для непосредственного наблюдения за морфологией биопленки под микроскоп, имеет ту же структуру, но производительность низкая, операция сложна, время культивирования велико. 4.2.1 Трубка-биопленка. Сфера применения: Метод культуры биопленки в трубках обычно подходит для следующих сценариев: (1) исследования, требующие моделирования среды роста биопленки в трубопроводе, (2) требуется относительно большое количество биопленки. Выборочные исследования, (3) исследования биопленок по метаболизму лекарств/соединений (биотрансформации) и т. д. Методы анализа биопленок, культивируемых в пробирках, в основном включают: анализ сухой/сырой массы (глава 5.4), экстракцию генома/транскриптома/протеома и анализ секвенирования, наблюдение с помощью электронной микроскопии (глава 5.7), кислородный зонд/обнаружение соединений. Игольчатый мониторинг и т. д. Следующие схематические устройства и операции основаны на Pseudomonas aeruginosa (PA) в качестве модельного штамма и проиллюстрированы в условиях аэробного культивирования: Метод трубчатой культуры биопленки имеет высокую производительность и позволяет одновременно культивировать многоканальные образцы биопленки; Метод может производить большое количество образцов биопленки одновременно и часто используется для анализа сухого/влажного веса, экстракции образцов генов, экстракции EPS и других метаболитов, наблюдения с помощью электронного микроскопа и наблюдения с помощью кислородного/химического зонда и т. д. Рисунок 5. Метод динамического культивирования биопленок in vitro (метод пробирочного культивирования) 4.2.1.1 Экспериментальные материалы: а) стерильная встряхиваемая пробирка объемом 15 мл б) длина 50 см, внутренний диаметр 1,0 мм Силиконовая трубка (смоченная) в .Длина 2520 см, внутренний диаметр 1,0 мм Силиконовая трубка насоса (увлажняющая); d.Длина 15 см, внутренний диаметр 1,0 мм Трубка из силикагеля (увлажняющая); Длина 10 см, внутренний диаметр 3,2 мм. Силиконовая трубка (увлажняющая); Трубка насоса (увлажненная); g. Прямой соединитель одинакового диаметра (увлажненный); h. Прямой соединитель переменного диаметра (увлажненный). i. Разъем Люэра (увлажненный). к. Две стеклянные культуры по 2 л. Бутылка к. 10% среда LB (другие среды могут быть использованы по требованию) л. Фильтр (отверстие фильтра 0,22 мкм) м. Перистальтический насос (аперистальтический насос, MasterFlex) п. Требуемые штаммы o. Контейнер для утилизации медицинских острых предметов; стр. 75% спирт; q. Пинцет; r. Стерильные шприцы емкостью 5 мл и 1 мл; s. стерильная игла; t. пипетка; u. стерильная пипетка. 4.2.1.2 Этапы культивирования [В приложении подробно поясняется режим протокола/СОП] Сначала стерилизуйте стеклянную культуральную бутылку, силиконовую трубку, пеногаситель и пинцет, содержащий культуральную среду, при температуре 121°C в течение 15 минут, выньте силиконовую трубку и пеногаситель и пинцет высохли и готовы к использованию. Как показано на рисунке 1, на стерильном операционном столе используйте силиконовую трубку b, снабженную двусторонним соединителем, для подключения стеклянной культуральной бутылки, содержащей культуральную среду, неблокирующего насоса, фильтра, силиконовых трубок c, d. , e, f и 2 л отработанной жидкости в порядке. Резервуары, по крайней мере, три параллельных в одном устройстве (одна параллель показана на рисунке), и поместите всю систему в инкубатор с постоянной температурой. Инокулируют целевой штамм в соответствующий объем среды LB и культивируют в течение ночи при встряхивании со скоростью 200 об/мин при необходимой температуре. На стерильном операционном столе используйте свежую культуральную среду LB, чтобы разбавить бактериальный раствор до OD600 нм = 0,1, используйте стерильную иглу, чтобы вдохнуть 2 мл разбавленного бактериального раствора, и введите разбавленный бактериальный раствор в параллельное устройство из силиконовой трубки b, и запечатайте силиконом. Инкубируйте в статическом режиме в течение 2 часов, чтобы бактериальные клетки прикрепились к стенкам пробирки, а затем инкубируйте с 10% проточной средой LB в течение 3–7 дней для образования биопленки. Сначала стерилизуют и собирают трубчатое устройство для культивирования биопленок. В культуральную стеклянную бутыль группы препаратов добавляют рабочую концентрацию целевого антибиотика и равномерно перемешивают, в культуральную стеклянную бутыль группы положительного контроля добавляют известный антибактериальный агент. до концентрации биопленки и равномерно перемешать; добавить равный объем растворителя антибиотика группы лекарств в среднюю стеклянную бутылку группы отрицательного контроля и равномерно перемешать. Группу лекарственного препарата, группу положительного контроля и группу отрицательного контроля инокулировали и культивировали в соответствии с этапами культивирования, описанными в Приложении X (Приложение Xe), а затем биопленки собирали для наблюдения. 4.2.1.3 Технические моменты a. Все операции должны строго соблюдаться в асептических рабочих процедурах. Во время операции обращайте внимание на использование стерилизующего оборудования и используйте спирт для дезинфекции операционного стола и используемого оборудования во избежание перекрестного загрязнения; b .Используйте иглы. После впитывания бактериальной жидкости иглой игла не должна быть обращена к оператору, а колпачок иглы нельзя надевать обратно, чтобы избежать случайной травмы оператора; C. Выбросьте использованный шприц и иглу в медицинский контейнер. Контейнер для утилизации острых предметов для унифицированной утилизации во избежание случайных травм оператора; d.Убедитесь, что насос без сопротивления работает с постоянной скоростью, чтобы избежать загрязнения, вызванного обратным потоком жидкости; e.Убедитесь, что толщина силиконовой трубки стенка подходит для того, чтобы вызвать разрыв стенок пробирки и повлиять на образование биопленки; е. При необходимости в процессе культивирования добавить в культуральную среду спирт, чтобы дезинфицировать горлышко бутылки и прилегающие поверхности устройства, чтобы избежать загрязнения; Горлышко культуральной бутылки должно быть закрыто воздухопроницаемой герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить испарение культуральной среды. 4.2.2. Биопленка на проточной ячейке. Сфера применения. Метод культуры биопленки на проточной ячейке обычно подходит для следующих сценариев: (1) соответствующие исследования, требующие наблюдения за морфологией биопленки в реальном времени, (2) в реальном времени. наблюдение за биологическими исследованиями. Связанные исследования по экспрессии и распределению маркерных белков/генов в биопленке; (3) исследования, которые требуют наблюдения в реальном времени относительного позиционного взаимодействия различных видов бактерий в сообществе биопленок и т. д. Методы анализа биопленок в пуловой культуре в основном включают: метод окрашивания мертвых и живых бактериальных клеток (глава 5.2), метод наблюдения с помощью лазерной конфокальной флуоресцентной микроскопии (глава 5.6), качественный и количественный метод трехмерной флуоресцентной визуализации (глава 5.5) и т. д. Следующие схематические устройства и операции основаны на Pseudomonas aeruginosa (PA) в качестве модельного штамма и выполняются в условиях аэробной культуры: метод пуловой культуры биопленки обычно применим к следующим сценариям: (1) Рисунок 6. Метод динамического культивирования биопленок in vitro (метод пулового культивирования) 4.2.2.1 Экспериментальные материалы: а) стерильная шейкерная пробирка емкостью 15 мл; б) трехканальный культуральный пул (3-канальная проточная кювета) и смола. Крышка; c. защитное стекло; d. силиконовый клей; e. длина 50 см, внутренний диаметр 1,0 мм, силиконовая трубка; силиконовая трубка насоса 1,0 мм, двусторонняя установка; g .Силиконовая трубка длиной 15 см, внутренним диаметром 1,0 мм; h. Силиконовая трубка насоса длиной 30 см, внутренним диаметром 1,0 мм; i. Прямой разъем одинакового диаметра; j. Коннектор Люэра; к. 2 стеклянные культуральные колбы емкостью 2 л; л. 10% среда LB (при необходимости можно использовать другие среды); м. фильтр (отверстие для фильтра 0,22 мкм). ; п. перистальтический насос (аперистальтический насос); о. необходимые штаммы; п. контейнер для утилизации острых медицинских предметов; q. 75% спирт; р. пинцет; 5 мл и Стерильные шприцы емкостью 1 мл, т. иглы стерильные, пипетки, тюбики. 4.2.2.2 Этапы культивирования [Подробно описано в приложении в режиме протокола/СОП] Сначала стерилизуйте и соберите устройство для культивирования пула биопленок, добавьте целевой антибиотик в рабочей концентрации в среднюю стеклянную бутылку группы лекарств и перемешайте. хорошо ; Добавьте известный колистин колистин с бактериостазом и концентрацией биопленки в среднюю стеклянную бутылку группы положительного контроля и равномерно перемешайте; хорошо перемешайте. Группу лекарственного препарата, группу положительного контроля и группу отрицательного контроля инокулировали и культивировали в соответствии с этапами культивирования, указанными в Приложении X (Приложение Xf), а затем биопленку собирали для наблюдения. 4.2.2.3 Технические моменты а. Все операции должны строго соблюдаться в асептическом рабочем процессе. Во время операции необходимо использовать стерилизованное оборудование и использовать спирт для дезинфекции операционного стола и используемого оборудования во избежание перекрестного загрязнения. ; B.После использования трубки иглы и иглы для поглощения бактериального раствора игла не должна быть обращена к оператору, а крышка иглы не должна быть закрыта назад, чтобы избежать случайной травмы оператора; C. Выбросьте использованную трубку иглы. и иглу в контейнер для утилизации медицинских острых предметов для унифицированного лечения во избежание случайных травм при работе с персоналом; d. Убедитесь, что неограниченный насос работает с одинаковой скоростью, чтобы избежать загрязнения, вызванного обратным потоком жидкости; e. Убедитесь, что резервуар для культуры перевернуты, чтобы не повлиять на образование биопленки; е. При склеивании культурального резервуара и крышки резервуара будьте осторожны, чтобы не повредить крышку резервуара, а культуральный резервуар и крышку резервуара должны быть полностью закрыты, чтобы избежать загрязнения. из-за перелива бактериального раствора и среды; ж. Убедиться, что все каналы культурального резервуара разблокированы, чтобы избежать обратного потока жидкости и загрязнения, вызванного закупоркой; з. В случае необходимости добавления среды во время культивирования Во время процесса необходимо использовать спирт для дезинфекции горлышка бутылки и поверхности прилегающего устройства, чтобы избежать загрязнения; i. Горлышко культуральной бутылки должно быть закрыто воздухопроницаемой герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить испарение среды.

T/CI 011-2021 История

• 2023 T/CI 011-2023 Технические условия на удаление побочных продуктов дезинфекции из водопроводной воды методом нанофильтрации
• 2022 T/CI 011-2022 Стандарты тестирования и оценки профессиональных способностей преподавателей китайского языка как иностранного
• 2021 T/CI 011-2021 Технические рекомендации по выращиванию, наблюдению и оценке лекарственной устойчивости бактериальной биопленки