SN/T 4675.29-2016
Метод флуоресцентной ПЦР в реальном времени для обнаружения Brettanomyces в экспортном вине (Англоязычная версия)
- Стандартный №
- SN/T 4675.29-2016
- язык
- Китайский, Доступно на английском
- Дата публикации
- 2016
- Разместил
- General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People‘s Republic of China
- Последняя версия
- SN/T 4675.29-2016
- сфера применения
-
Техническое обоснование стандарта
Настоящий стандарт, часть 29 серии SN/T 4675, специально разработан для молекулярного обнаружения Brettanomyces bruxellensis (brettanomyces) в экспортной торговле вином. Этот микроорганизм может вызывать появление фенольных привкусов в вине и является ключевым объектом мониторинга международной торговли.
Сравнение принципов метода
Параметры обнаружения Традиционный метод культивирования Метод флуоресцентной ПЦР в реальном времени Цикл обнаружения 5-7 дней ≤4 часов Чувствительность 10² КОЕ/мл 10⁰-10¹ КОЕ/мл Специфичность Подверженность помехам со стороны Различные бактерии Нацеливание на ген RAD4
Ключевые рабочие моменты
Оптимизация извлечения ДНК
Для разрушения клеточной стенки дрожжей использовался PVPP (сшитый поливинилпирролидон) в сочетании с измельчением в жидком азоте, а качество ДНК обеспечивалось двухэтапной очисткой с использованием CTAB-хлороформа (требуемое соотношение A260/A280 должно быть 1,7–1,9).
Дизайн праймера и зонда
Разработано для специфического гена RAD4 Brettanomyces bruxellensis:
Прямой праймер: 5'-GTT CAC ACA ATC CCC TCG ATC AAC-3'
Обратный праймер: 5'-TGC CAA CTG CCG AAT GTT CTC-3'
Зонд, меченый FAM: 5'-ATG GCG AGG ATG AAA GTT TGG GAT ACA-3'
Рекомендации по внедрению
- Лаборатории необходимо проверить специфичность праймера с использованием стандартного штамма NBIRC 0628
- Рекомендуется установить три параллельных контроля для каждой партии тестирования: положительный контроль (NBRC 0628), отрицательный контроль (буфер TE) и холостой экстракции
- Определение критического значения (значение Ct 35–40) требует повторного тестирования и подтверждения
Анализ эволюции технологий
По сравнению с версией метода культивирования 2010 года, этот стандарт вводит:
1. Технология очистки с помощью магнитных частиц заменяет экстракцию фенолхлоридом
2. Оптимизированную процедуру амплификации: 95 °C 10 мин предварительная денатурация → 50 циклов (95 °C 30 с → 58 °C 20 с → 72 °C 20 с)
3. Значение ΔCt добавлено для облегчения анализа результатов
SN/T 4675.29-2016 Ссылочный документ
- GB 19489 Лаборатории. Общие требования биобезопасности.
- GB/T 1.1-2009 Директивы по стандартизации. Часть 1: Структура и разработка стандартов.
- GB/T 27403 Критерий контроля качества лабораторий. Молекулярно-биологическое тестирование пищевых продуктов.
SN/T 4675.29-2016 История
- 2016 SN/T 4675.29-2016 Метод флуоресцентной ПЦР в реальном времени для обнаружения Brettanomyces в экспортном вине
