Область применения Настоящий стандарт распространяется на определение Aspergillus niger в винограде. Настоящий стандарт определяет метод определения Aspergillus niger в винограде. Этот документ применим к обнаружению Aspergillus niger в свежем винограде и изюме в Синьцзяне. 2Нормативно-справочные документыДокументы, цитируемые в настоящем документе, необходимы для применения настоящего документа. Для датированных ссылок к настоящему документу применяется только датированная версия. Для недатированных справочных документов к настоящему документу применяется последняя версия (включая все поправки). GB/T6682 Аналитическая лаборатория использует указанную первоклассную воду. 3Термины и определения3.1Свежий виноградСвежийвиноград относится к свежему, чистому винограду, который был обработан или хранится в свежем виде. 3.2 Изюм Изюм получают путем обезвоживания плодов винограда путем естественной воздушной сушки или искусственного нагревания. 3.3 Aspergillus Aspergillus niger Aspergillus niger — распространенный вид грибов рода Deuteromycotina, Hyphomycetes, Hyphospora, Polygonaceae и Aspergillus. Его легко выращивать и размножать в условиях высокой температуры и высокой влажности, и он в основном рождается на сочных плодах, вызывая гниение и порчу. 4. Принцип. Aspergillus niger в зараженном винограде можно культивировать на картофельно-декстрозном агаре при 28°C в течение 5 дней для выявления гриба и выделения из него Aspergillus niger. Число Aspergillus niger находится в середине. 5 Среда и реагенты 5.1 Среда 5.1.1 Картофельно-декстрозный агар (КПК). 5.1.2 2% крахмала, среда Чада. 5.2 Реагент 5.2.1 Стерильный физиологический раствор. 5.2.2 Реактив I2-Ki (раствор для окрашивания пыльцы). 6 Стандартный штамм 6.1 Стандартный штамм Aspergillus niger 7 Инструменты и оборудование 7.1 Инкубатор: 28℃±1℃. 7.2 Гомогенизатор шлепкового типа и мешок для гомогенизации. Электронные весы: Чувствительность: 0,1 г. 7.3 Стерильная колба Эрленмейера: вместимость: 500 мл. 7.4 Стерильные пипетки: 1 мл (со шкалой 0,01 мл), 10 мл (со шкалой 0,1 мл). 7.5 Стерильная пробирка: 18×180 мм. 7.6 Вихревой смеситель. 7.7 Стерильная плоская посуда диаметром 90 мм. 7.8 Водяная баня постоянной температуры: 46°C ± 1°C. 7.9 Микроскоп: 10x~100x. 7.10. Микропипетка и наконечник: 1,0 мл. 7.11 Измерительное предметное стекло Хао: специальное предметное стекло со стандартной измерительной камерой. покровное стекло. 7.12 Микрометр: предметное стекло со стандартной шкалой. 7.13 Электронные весы: чувствительность 0,01g. 7.14 Генератор 8. Программа обнаружения представлена на рисунке 1. Рисунок 1. Процедура определения количества Aspergillus niger 8.1. Этапы тестирования: 8.1.1. Взвесьте 25 г образца в стерильный однородный пакет, наполненный 225 мл физиологического раствора, взбейте его гомогенизатором в течение 1–2 минут, чтобы приготовить Образец гомогенного раствора 1:10. 8.1.2 Возьмите 1 мл гомогенного раствора образца 1:10 и введите его в пробирку, содержащую 9 мл стерильного разбавителя, замените другую стерильную пипетку емкостью 1 мл, чтобы несколько раз продуть и отсосать, или равномерно перемешайте в вихревом миксере. ;1:100 образец гомогенного раствора. 8.1.3 Следуя операции 5.1.3, приготовьте 10-кратную возрастающую серию разбавленных образцов гомогенных растворов. Для каждого постепенного разведения используйте стерильную пипетку объемом 1 мл. 8.1.4 В соответствии с оценкой статуса загрязнения пробы отберите 2–3 гомогенных раствора пробы с соответствующими разведениями и одновременно с выполнением 10-кратных дополнительных разведений отнесите пипеткой по 1 мл гомогенных растворов проб для каждого разведения соответственно в 2 в бактериальной пластинке. В то же время добавьте по 1 мл стерильного раствора для разведения в 2 стерильных планшета в качестве холостого контроля. 8.1.5 Своевременно налейте 15–20 мл картофельно-декстрозного агара, охлажденного до 46°C (его можно хранить на водяной бане с постоянной температурой 46°C±1°C), вылейте в чашку и вращайте чашку, чтобы перемешать. равномерно. Поместите на стол с водой до полного затвердевания питательной среды. 8.2 После затвердевания культурального агара поместите чашку вертикально и поместите ее в инкубатор с температурой 28°C + 1°C. Наблюдайте и записывайте результаты 5-го дня культивирования. (Примечание: если степень загрязнения слишком высока, наблюдение можно начать на 3-й день.) 9 Биохимический эксперимент. Для проведения идентификационного теста отберите более 2 типичных или подозрительных колоний из чашки с селективным агаром. 9.1 Наблюдение за колонией Aspergillus niger Колония Aspergillus niger быстро распространяется, но рост несколько ограничен. Мицелий белый, затем становится ярко-желтым до черного, плотный бархатистый, спинка бесцветная или центр слегка желтовато-коричневый, а верхняя часть образует сферическую верхнюю сумку. Головки конидиев шаровидные, диаметром 700-800 мкм, коричнево-черные. 9.2 Эксперимент по разложению крахмала: Эксперимент по разложению крахмала: используют 2%-ную крахмальную среду Чада. Используйте инокуляционную петлю, чтобы соскоблить кольцо очищенных спор Aspergillus niger в коническую колбу, содержащую 100 мл стерильного физиологического раствора и стеклянные шарики, и встряхнуть. Возьмите 1 мл суспензии спор и введите ее в чашку со средой Chapeur с 2% крахмалом и культивируйте в перевернутом виде при 37°C в течение 2 дней, добавьте в среду реагент I2-Ki (раствор для окрашивания жизнеспособности пыльцы) и измерьте рост. Размер колонии измеряют линейкой.Прозрачный круг измеряют и записывают. 9.3 Идентификация производства лимонной кислоты. Используйте стерильную инокуляционную петлю, чтобы аккуратно соскрести гифы и споры типичных или подозрительных бактерий, приготовить бактериальную суспензию в стерильной воде и поместить ее в коническую колбу со средой PDA (картофельно-декстрозный агар). Встряхнуть хорошо. Поместите в шейкер и инкубируйте при 35°C и 200 об/мин в течение 2 дней. Наберите в пробирку 5 мл ферментационного бульона и капните в него насыщенный раствор СаСО3. Если выпадет белый осадок, это свидетельствует о выработке лимонной кислоты. Aspergillus niger производит лимонную кислоту. 10. Подсчет колоний основан на Национальном стандарте безопасности пищевых продуктов GB 4789.15-2016. Подсчет плесени и дрожжевых грибков, выбранные чашки с типичными колониями Aspergillus niger, выражают в колониеобразующих единицах (КОЕ). Выберите чашку с колониями в диапазоне от 10 КОЕ до 150 КОЕ и подсчитайте Aspergillus niger в соответствии с морфологией колонии. Если колония вырастает и покрывает всю чашку, это можно зарегистрировать как распространение колонии. 11. Результаты и отчеты. 11.1. Результаты 11.1.1. Рассчитайте среднее количество колоний на двух чашках с одинаковым разведением, а затем умножьте среднее значение на соответствующий коэффициент разведения. 11.1.2 Если количество колоний на двух чашках для разведения находится в пределах от 10 КОЕ до 150 КОЕ, расчет следует проводить согласно соответствующим правилам GB 4789.2. 11.1.3 Если количество колоний на всех чашках превышает 150 КОЕ, подсчитывают чашку с наибольшим разведением и записывают количество остальных чашек как несчетное.Результат рассчитывают путем умножения среднего количества колоний на наибольшее разведение. фактор. 11.1.4 Если количество колоний на всех чашках менее 10 КОЕ, расчет следует основывать на среднем количестве колоний с наименьшим разведением, умноженном на коэффициент разведения. 11.1.5 Если количество колоний в чашке при всех разведениях не находится в пределах 10 КОЕ и 150 КОЕ, а некоторые из них составляют 10 КОЕ или 150 КОЕ, среднее количество колоний, наиболее близких к 10 КОЕ или 150 КОЕ, следует умножить на коэффициент разведения. 11.2 Отчет 11.2.1 Число колоний округляется по принципу «округления». Если количество колоний находится в пределах 10, укажите одну значащую цифру; если количество колоний находится в пределах от 10 до 100, укажите две значащие цифры. 11.2.2Когда количество колоний больше или равно 100, первые 3 цифры округляются по принципу «округления» и берутся первые 2 цифры, за которыми вместо цифр следует 0 для обозначения результат; он также может быть выражен в виде индекса 10. При этом договор также пересматривается по принципу «округления до пяти человек» и используются две значащие цифры. 11.2.3. Если на пустом контрольном планшете присутствуют колонии, результат анализа недействителен. 11.2.4. Результаты взвешивания и отбора проб должны указываться в КОЕ/г.
T/AFFI 039-2023 История
2023T/AFFI 039-2023 Определение Aspergillus niger в свежем винограде и изюме.