SC/T 7225-2017
Метод обнаружения реовируса белого амура с помощью петли обратной транскрипции (RT-LAMP) (Англоязычная версия)
- Стандартный №
- SC/T 7225-2017
- язык
- Китайский, Доступно на английском
- Дата публикации
- 2017
- Разместил
- Professional Standard - Aquaculture
- Последняя версия
- SC/T 7225-2017
- сфера применения
-
Анализ стандартной технической структуры
Настоящий стандарт устанавливает систему изотермической амплификации с обратной транскрипцией (RT-LAMP), основанную на металлической ванне с постоянной температурой. Для гена RdRp реовируса белого амура (GCRV) разработаны три набора специфических праймеров, а быстрое обнаружение патогена достигается посредством изотермической амплификации при 65°C в течение 40 минут.
Основные элементы обнаружения
Этапы обнаружения Ключевые технологии Точки контроля качества Экстракция РНК Метод Trizol/метод набора Обработка воды DEPC для предотвращения загрязнения РНКазой Система праймеров Набор праймеров, специфичных для генов типа I/II/III Концентрат праймера хранился при температуре -20℃, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания Условия амплификации ДНК-полимераза Bst + обратный AMV транскриптаза Концентрация бетаина 0,4 моль/л, оптимизация эффективности амплификации Определение результата Развитие флуоресценции SYBR Green I Наблюдение на черном фоне для предотвращения сильных световых помех
Стратегия генотипирования вирусов
В Приложении A к стандарту представлена подробная информация о целевой последовательности для трех наборов праймеров:
- Генотип I: нацеливание на сегмент последовательности AF260512 1471-1751
- Генотип II: нацеливание на сегмент последовательности GQ896335 1961-2241
- Генотип III: нацеливание на сегмент последовательности JN967630 1611–1891
В реальных тестах рекомендуется использовать смешанный праймер D для начального скрининга, а затем использовать наборы праймеров A/B/C для генотипирования положительных образцов.
Рекомендации по внедрению стандарта
- Характеристики отбора проб: У рыб с длиной тела более 6 см необходимо взять почки и селезенку, а у бессимптомных рыб необходимо увеличить отбор проб жаберной ткани
- Меры по борьбе с загрязнением:
- Экспериментальное разделение: Физическая изоляция зоны экстракции РНК/зоны амплификации/зоны анализа продукта
- Утилизация расходных материалов: Все пластиковые изделия необходимо замочить в 0,1% воде DEPC
- Предотвращение и контроль ложноположительных результатов:
- Для каждой партии тестирования необходимо установить пустой контроль (вода DEPC заменяет шаблон)
- Рекомендуется использовать инактивированная вирусная РНК вместо живого вируса для положительного контроля
Предыстория технологической эволюции
По сравнению с традиционной технологией ПЦР, технология RT-LAMP, используемая в этом стандарте, имеет следующие преимущества:
- Низкий порог для оборудования: требуется только водяная баня с постоянной температурой, что делает ее подходящей для низовых лабораторий
- Быстрое время обнаружения: амплификация завершается за 40 минут, что на 60% меньше по сравнению с ПЦР
- Высокая чувствительность: можно обнаружить 102 копий/мкл вирусной РНК
С момента выпуска в 2017 году этот стандарт стал основным методом карантина геморрагической болезни белого амура в моей стране. Сопутствующие запатентованные технологии (например, ZL201410683383.7) добились совместимости между платформами визуализации и двойного обнаружения флуоресценции.
SC/T 7225-2017 Ссылочный документ
- GB/T 18088 Отбор проб для ввоза и выезда из карантина животных
- GB/T 6682 Вода для аналитических лабораторий. Спецификация и методы испытаний.
- SC/T 7103 Протоколы отбора проб для карантина водных животных на производственной территории
SC/T 7225-2017 История
- 2017 SC/T 7225-2017 Метод обнаружения реовируса белого амура с помощью петли обратной транскрипции (RT-LAMP)
